背景[1-3]
NCI-H23人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞源于一位51歲患有非小細(xì)胞肺癌黑人男性患者的治療前的腫瘤組織，表達(dá)C-myc、L-myc、v-src、v-abl、v-erb B、c-raf 1、Ha-ras、Ki-ras、N-ras RNAs；該細(xì)胞攜帶K-ras 12突變；p53基因246位密碼子突變ATC→ATG；表達(dá)PDGF A和B鏈的異源mRNA；表達(dá)TGFα、TGFβ和EGFR；角蛋白5、8和18陽性，波形蛋白陽性，神經(jīng)絲蛋白陰性，左旋多巴脫氫酶陰性；據(jù)報(bào)道，在軟瓊脂中該細(xì)胞形成克隆的效率為9.7%。
NCI-H23人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；+1%Glutamax+1%Sodium Pyruvate，雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
應(yīng)用[4][5]
用于10-羥基癸烯酸對肺癌A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及抑制遷移作用的研究
采用乙醇提取法確定從蜂王漿中提取10-HDA的工藝參數(shù);采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法檢測10-HDA對人三種肺癌細(xì)胞（A549、NCI-H460、NCI-H23）的殺傷作用和對三種正常細(xì)胞（IMR-90、L-02、GES-1）的毒副作用;采用Hochest 33342/PI雙染后熒光顯微鏡觀察法及流式細(xì)胞術(shù)檢測10-HDA對肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用;
采用流式細(xì)胞術(shù)檢測10-HDA對肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的調(diào)控作用及對肺癌細(xì)胞周期阻滯作用;采用細(xì)胞劃痕法檢測10-HDA對肺癌細(xì)胞遷移的抑制作用;采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測10-HDA對肺癌細(xì)胞凋亡、周期、遷移及信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化情況。
結(jié)果顯示,乙醇提取法提取10-HDA的工藝參數(shù)為料液比1:6、乙醇濃度90%、萃取次數(shù)2次,提取率可達(dá)到3.316%;經(jīng)過細(xì)胞實(shí)驗(yàn),與陽性對照5-FU組相比,10-HDA對人三種肺癌細(xì)胞具有殺傷作用,且對三種正常細(xì)胞沒有明顯的毒副作用;
10-HDA通過下調(diào)肺癌A549細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/BAX的比例,細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降,引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡;10-HDA通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,激活JNK、p38信號(hào)通路,抑制ERK、STAT3和NF-κB信號(hào)通路,使caspase-3蛋白表達(dá)含量增加,從而誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡;
11-10-HDA通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,抑制AKT信號(hào)通路的過度激活,增加p21和p27的蛋白表達(dá)量,降低Cyclin D1/E與CDK2/4/6的蛋白表達(dá)量,使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期;10-HDA可以顯著下調(diào)TGF-β1、SNAI1、GSK-3β、N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)量,上調(diào)E-cadherin的蛋白表達(dá)量,抑制TGF-β信號(hào)通路的激活,阻滯EMT的發(fā)生,從而抑制肺癌A549細(xì)胞遷移。
綜上所述,總結(jié)出了乙醇提取法提取10-HDA的工藝參數(shù)。同時(shí)總結(jié)出10-HDA對肺癌A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及抑制遷移作用的主要機(jī)制。
參考文獻(xiàn)
[1]Dioscin facilitates ROS-induced apoptosis via the p38-MAPK/HSP27-mediated pathways in lung squamous cell carcinoma.[J].International journal of biological sciences.2020(15)
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[3]Transforming growth factor-β1 enhances proliferative and metastatic potential by up-regulating lymphoid enhancer-binding factor 1/integrinαMβ2 in human renal cell carcinoma.[J].Liu Yuting,Shang Donghao.Molecular and cellular biochemistry.2020(1-2)
[4]Solvent fractions of fermented Trapa japonica fruit extract stimulate collagen synthesis through TGF-β1/GSK-3β/β-catenin pathway in human dermal fibroblasts.[J].Nam Gun-He,Kawk Hye Won,Kim Sang-Yong,Kim Young-Min.Journal of cosmetic dermatology.2020(1)
[5]林欣梅.10-羥基癸烯酸對肺癌A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及抑制遷移作用的研究[D].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2021.