背景[1-3]
NR8383(大鼠肺泡巨噬細(xì)胞)來(lái)源于肺灌洗時(shí)的正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞。細(xì)胞在gerbil肺細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)液存在下培養(yǎng)了大約8-9個(gè)月。隨后，不再需要外源生長(zhǎng)因子。通過(guò)有限稀釋法從單個(gè)細(xì)胞克隆并亞克隆NR8383細(xì)胞，并三次用軟瓊脂亞克隆。細(xì)胞表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞的特性，吞噬酵母多糖和銅綠，非特異性脂酶活性，F(xiàn)c受體，氧化降解；分泌IL-1,TNFbeta和IL-6，可重復(fù)地響應(yīng)外源生Chemicalbook長(zhǎng)因子。NR8383細(xì)胞響應(yīng)博萊霉素，分泌TGFbeta前體。在博萊霉素刺激下，TGFbetamRNA表達(dá)也上升。細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素敏感。1-10ng/mL的LPS水平抑制增生達(dá)50%。即使達(dá)到0.001mg/mL的水平，LPS抑制還是無(wú)毒且在后續(xù)過(guò)程中可逆的。NR8383細(xì)胞株提供了高響應(yīng)的肺泡巨噬細(xì)胞的均一來(lái)源，可以用于體外研究巨響細(xì)胞相關(guān)活性，此細(xì)胞懸浮-貼壁混合生長(zhǎng)。
NR8383(大鼠肺泡巨噬細(xì)胞)
培養(yǎng)步驟：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。也可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
應(yīng)用[4][5]
用于納米二氧化鈰對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RPAEpiC的作用研究
以大鼠肺巨噬細(xì)胞NR8383、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RPAEpi C為研究對(duì)象,對(duì)納米氧化鈰的生物效應(yīng)及其毒理學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,在細(xì)胞水平體外考察納米氧化鈰對(duì)生物體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和毒性作用。
方法：將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),加氧化鈰,劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn):加濃度為5、10、20、50、100mg/ml的20nm Ce O2;尺寸效應(yīng)實(shí)驗(yàn):加濃度為100mg/ml的35nm、68nm、287nm、1-5mm Ce02;比較實(shí)驗(yàn)1:20nm Ce O2、34nm Zn O、24nm Si O2;比較實(shí)驗(yàn)2:287nm Ce O2、300nm Nd2O3。陰性對(duì)照組（0mg/ml）加入10ml無(wú)血清培養(yǎng)液。干預(yù)24h后檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞通透性、氧化應(yīng)激、炎性因子釋放、細(xì)胞凋亡和周期、吞噬功能。
結(jié)果：（1）劑量效應(yīng)研究:10-100mg/ml細(xì)胞存活率隨濃度增大而升高,在100mg/ml時(shí)存活率最高,納米氧化鈰在本實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)間對(duì)細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生抑制作用。LDH含量都比對(duì)照組有明顯的升高,各濃度納米氧化鈰均使膜通透性增大,10-50mg/ml時(shí),細(xì)胞通透性隨劑量增加而增大,100mg/ml作用下膜通透性改變稍比其它劑量小,劑量效應(yīng)不顯著。SOD含量與對(duì)照組相比,在10-50mg/ml時(shí),SOD值略有下降,在5、100mg/ml時(shí)SOD值升高,表現(xiàn)較低濃度和較高濃度的損傷作用較弱。10-50mg/ml納米氧化鈰作用下NO含量略有下降,NO含量低于對(duì)照組,5、100mg/ml時(shí)NO含量與對(duì)照組相近。6h時(shí),0-5mg/ml作用下促進(jìn)凋亡,后隨著劑量增加,抑制凋亡作用增加;12h時(shí),0-10mg/ml隨劑量增加逐漸促進(jìn)凋亡,后隨著劑量增加,抑制凋亡作用增加;24h時(shí),0-10mg/ml隨劑量增加逐漸促進(jìn)凋亡,后隨著劑量增加,促進(jìn)凋亡作用減弱,最后抑制凋亡,并抑制凋亡逐漸增加。
（2）尺寸效應(yīng)研究:納米組氧化鈰增加細(xì)胞存活率,1-5mm組氧化鈰表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖;各粒徑組均使LDH含量增高,表明致膜通透性均增大,1-5mm組使膜通透性改變。納米組氧化鈰均使NO降低,1-5mm組NO含量升高。表現(xiàn)出納米組氧化鈰無(wú)明顯細(xì)胞毒性,微米組氧化鈰可能有細(xì)胞毒性。
（3）三種納米氧化物的比較研究:納米氧化鈰使NO含量下降,對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。納米氧化硅NO含量升高,有弱毒性作用。納米氧化鋅NO升高,有明顯毒性作用。結(jié)論納米氧化鈰作用于大鼠肺泡上皮細(xì)胞RPAEpi C和大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383 24h,總體劑量效應(yīng)不明顯:在所選濃度范圍內(nèi)作用下,均沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞損傷作用,均能被細(xì)胞攝入,5和100mg/ml對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)作用較其它濃度輕。
參考文獻(xiàn)
[1]Forming-free bipolar resistive switching in nonstoichiometric ceria films[J].Muhammad Ismail,Chun-Yang Huang,Debashis Panda,Chung-Jung Hung,Tsung-Ling Tsai,Jheng-Hong Jieng,Chun-An Lin,Umesh Chand,Anwar Manzoor Rana,Ejaz Ahmed,Ijaz Talib,Muhammad Younus Nadeem,Tseung-Yuen Tseng.Nanoscale Research Letters.2014(1)
[2]Photocurrent response and semiconductor characteristics of Ce-Ce 2 O 3-CeO 2-modified TiO 2 nanotube arrays[J].Yu Tan,Shenghan Zhang,Kexin Liang.Nanoscale Research Letters.2014(1)
[3]Long-term aging of a CeO 2 based nanocomposite used for wood protection[J].Melanie Auffan,Armand Masion,Jerome Labille,Marie-Ange Diot,Wei Liu,Luca Olivi,Olivier Proux,Fabio Ziarelli,Perrine Chaurand,Christophe Geantet,Jean-Yves Bottero,Jerome Rose.Environmental Pollution.2014
[4]Ceria nanocubic-ultrasonication assisted dispersive liquid–liquid microextraction coupled with matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for pathogenic bacteria analysis[J].Hani Nasser Abdelhamid,Mukesh L.Bhaisare,Hui-Fen Wu.Talanta.2014
[5]呂麗萍.納米二氧化鈰對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383、大鼠肺泡上皮細(xì)胞RPAEpiC的作用研究[D].內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,2015.