背景[1-3]
OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞具有高度增殖能力和侵襲性，能夠迅速擴(kuò)散到周圍組織和遠(yuǎn)處器官。因此，它被廣泛用于評估抗腫瘤藥物的療效和毒性，以及開發(fā)新型的抗腫瘤治療方法。此外，OCM-1A細(xì)胞系也被用于研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，以及探索新的靶點和治療方法。
OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞
OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞可以用于miR-200c/Zeb1負(fù)反饋回路對眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成瘤性的作用
研究microRNA-200c與Zeb1構(gòu)成的雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)通道對眼內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、成瘤能力及遷徙轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用。
方法1)miR-200c對眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及遷徙能力的調(diào)控。①建立miR-200c過表達(dá)及表達(dá)抑制的細(xì)胞模型。應(yīng)用miR-200c的模擬物和抑制劑對人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株OCM-1、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株WERI-RB1和Y79進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,在三個細(xì)胞株中建立miR-200c過表達(dá)及表達(dá)抑制的細(xì)胞模型。通過對miR-2O0c載體所攜帶的FAM熒光對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況進(jìn)行熒光顯微鏡下的肉眼觀察,初步評估轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用實時定量PCR對轉(zhuǎn)染前后各株細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)水平進(jìn)行檢測進(jìn)一步評估轉(zhuǎn)染效率。
②miR-200c對其靶基因——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的重要轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的調(diào)節(jié)作用。使用實時定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測方法對OCM-1、WERI-RB1和Y79細(xì)胞miR-200c轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測,以驗證miR-200c在眼內(nèi)腫瘤對Zebl的調(diào)控作用。
③miR-200c對眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控。使用實時定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測方法,對三個細(xì)胞株miR-200c轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)上皮標(biāo)記因子E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)記因子Vimentin和N-cadherin分別進(jìn)行不同表達(dá)水平的定性、定量和定位,以檢驗miR-200c對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控作用。
④miR-200c對眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞體外遷徙能力的調(diào)控。利用Transwell小室對OCM-1和Y79細(xì)胞各組(未轉(zhuǎn)染組、空白對照轉(zhuǎn)染組、模擬物WERI-RB1轉(zhuǎn)染組、抑制劑轉(zhuǎn)染組)進(jìn)行體外透膜遷徙能力檢測,以評估的表達(dá)干擾對眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞運動能力的作用。
參考文獻(xiàn)
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[5]邵曉蕾.miR-200c/Zeb1負(fù)反饋回路對眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成瘤性的作用[D].中南大學(xué),2013.