背景^[1-3]

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞是一種人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系，來(lái)源于一個(gè)乳腺癌患者的乳腺腫瘤組織。這種細(xì)胞系最初是由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（National Cancer Institute）的細(xì)胞生物學(xué)家J.W.Shay于1979年首次建立。BT-549細(xì)胞系具有高度浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性，能夠在體內(nèi)形成腫瘤并產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞來(lái)源組織是一個(gè)乳頭狀侵入性導(dǎo)管瘤，7個(gè)局部淋巴結(jié)中3個(gè)已有轉(zhuǎn)移。建立的細(xì)胞是多態(tài)性的，包括上皮細(xì)胞樣組分和多核巨細(xì)胞。向培養(yǎng)基中分泌黏液素樣物質(zhì)。

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

一．人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1)準(zhǔn)備：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)凍存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

二．人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

注：次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。

3）人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物（mingzhoubio）按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞可以用于轉(zhuǎn)染beclin1對(duì)三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞EMT過(guò)程和化療敏感性的影響

研究擬通過(guò)在三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)beclin1基因,觀察Beclin1對(duì)TNBC的EMT過(guò)程和化療敏感性等方面的影響,進(jìn)而探討通過(guò)Beclin1降低TNBC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及增強(qiáng)化療敏感性的可能性。

本實(shí)驗(yàn)共分二個(gè)部分：部分,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)beclin1基因的三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞系,并研究Beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞EMT過(guò)程的影響；第二部分,研究Beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU和紫杉醇敏感性的影響,并探索相關(guān)的機(jī)制。

部分beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞的EMT過(guò)程的影響目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)beclin1基因的三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞系,并研究Beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞EMT過(guò)程的影響,并研究其對(duì)BT-549細(xì)胞侵襲性和遷移能力的影響。

方法：通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染方法將pLenO-GTP-BECN1真核表達(dá)載體導(dǎo)入BT-549細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)beclin1基因的BT-549細(xì)胞系,相同方法構(gòu)建陰性對(duì)照組細(xì)胞,經(jīng)熒光顯微鏡、real-time PCR和western blot鑒定細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)所需；根據(jù)載體種類(lèi)將BT-549細(xì)胞分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：pLenO-GTP-BECN1組(目的基因組)、pLenO-GTP組(陰性對(duì)照組)和未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)；transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力；transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力；real-time PCR和western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞EMT上皮性標(biāo)志分子E-cadherin和間質(zhì)性標(biāo)志分子N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)情況。

結(jié)果：慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選完成后,熒光顯微鏡下可見(jiàn)pLenO-GTP-BECN1組和pLenO-GTP組BT-549細(xì)胞GFP表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染組,real-time PCR和western blot結(jié)果顯示pLenO-GTP-BECN1組Beclin1mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組(p<0.01),提示成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)beclin1基因的BT-549細(xì)胞系；transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pLenO-GTP-BECN組細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于其他兩組(p<0.01),提示pLenO-GTP-BECN組細(xì)胞侵襲性顯著降低；transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pLenO-GTP-BECN組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)較其他兩組顯著降低(p<0.05),提示pLenO-GTP-BECN組細(xì)胞遷移能力顯著降低；對(duì)于各組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子檢測(cè)結(jié)果顯示,pLenO-GTP-BECN1組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)顯著高于其他兩組(p<0.05),而N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)顯著降低(p<0.05)。結(jié)論：Beclin1可逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞EMT過(guò)程,并導(dǎo)致細(xì)胞侵襲性和遷移能力下降。

第二部分beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞化療敏感性的影響目的：研究Beclin1對(duì)BT-549細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU和紫杉醇敏感性的影響,并探索相關(guān)的機(jī)制。

方法：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度抗腫瘤藥物分別作用一定時(shí)間對(duì)各組BT-549細(xì)胞的增殖抑制情況;Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342染色法檢測(cè)50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分別處理48h后各組細(xì)胞凋亡情況；吖啶橙染色法檢測(cè)50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分別處理48h后各組細(xì)胞內(nèi)自噬性酸性囊泡形成情況；western blot檢測(cè)50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分別處理48h后各組細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)情況。

結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)顯示,分別接受5-FU和紫杉醇處理時(shí),pLenO-GTP-BECN1組BT-549細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于其他兩組(p<0.05)；Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342實(shí)驗(yàn)顯示,化療藥物處理后pLenO-GTP-BECN1組細(xì)胞凋亡顯著增加(p<0.05),細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡性變化更明顯；吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)顯示,化療藥物處理后pLenO-GTP-BECN1組細(xì)胞自噬激活現(xiàn)象較其他兩組更明顯；western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化療藥物處理后pLenO-GTP-BECN1組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和LC3B蛋白表達(dá)均顯著高于其他兩組(p<0.05)。

結(jié)論：Beclin1可顯著提高三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞的化療敏感性,而其中涉及的機(jī)制包括提高三陰性乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性、激活過(guò)度自噬發(fā)生和逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程等。

參考文獻(xiàn)

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