背景^[1-3]

羊巴貝斯蟲PCR試劑盒是利用pcr技術(shù)來檢測含有羊巴貝斯蟲的樣本，羊巴貝斯蟲PCR試劑盒參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

羊巴貝斯蟲

羊巴貝斯蟲PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

3.產(chǎn)品精心優(yōu)化且特異性高，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟除此之外的其它微生物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

4.PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。

5.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的PCR反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于定性實(shí)驗(yàn)，不能用于定量。

羊巴貝斯蟲PCR試劑盒樣品的制備

1.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取反應(yīng)，多出的兩個(gè)中一個(gè)是PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL牛乳頭瘤病毒PCR陽性對照（1×10E6拷貝/μL，本試劑盒提供）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

2.用自選方法純化上述N+2個(gè)樣品的DNA。本試劑盒跟市場上大多數(shù)細(xì)菌DNA提取試劑盒兼容。

羊巴貝斯蟲PCR試劑盒電泳分析

1.取5-10uL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)瓊脂糖電泳，檢測擴(kuò)增效果，由于擴(kuò)增產(chǎn)物較短，建議用1.5%-2.0%的瓊脂糖凝膠。

2.陽性樣品預(yù)期得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為200bp左右。如果兩個(gè)陰性對照（樣品制備陰性對照或PCR陰性對照）有此擴(kuò)增產(chǎn)物，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.如果所有樣品和PCR陽性對照均無此擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明有系統(tǒng)性的問題（試劑、設(shè)備、程序、操作等），需要重復(fù)并排查原因。

4.如果沒有上述兩種情況，則實(shí)驗(yàn)有效，可以分析樣品的擴(kuò)增結(jié)果。N+2個(gè)樣品中有擴(kuò)增產(chǎn)物的判定為陽性，無則判定為陰性。

應(yīng)用^[4-5]

羊巴貝斯蟲PCR試劑盒可以用于我國羊巴貝斯蟲TRAP蛋白的分析及多重PCR方法的建立

羊巴貝斯蟲病(Ovine babesiosis)是由媒介蜱傳播的一種血液原蟲病,患病動(dòng)物臨床表現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿等癥狀,嚴(yán)重感染時(shí)可引起死亡。

通過克隆我國分離的2種6株羊巴貝斯蟲trap基因全長,分析其結(jié)構(gòu)特征,并以其為靶基因?qū)ξ覈虬拓愃瓜x的分類關(guān)系進(jìn)行分析;表達(dá)重組TRAP蛋白,測定其反應(yīng)原性;建立羊巴貝斯蟲PCR試劑盒多重PCR檢測方法,并應(yīng)用該方法對我國9省采集的羊血樣進(jìn)行檢測。

目的是為了闡明羊巴貝斯蟲trap基因結(jié)構(gòu),測定其作為免疫學(xué)和分子診斷靶標(biāo)的可能性,同時(shí)為進(jìn)一步確認(rèn)我國羊巴貝斯蟲的分類關(guān)系和該病在我國的流行狀況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

現(xiàn)將研究內(nèi)容總結(jié)如下:1.通過動(dòng)物感染試驗(yàn),獲得6株羊巴貝斯蟲的陽性血清、純化的裂殖子、基因組DNA等標(biāo)準(zhǔn)樣品?？寺∑鋞rap基因的全長序列,生物信息學(xué)分析其核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征;并以其為靶標(biāo)分子,對我國羊巴貝斯蟲的分類地位進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示,我國分離的羊巴貝斯蟲存在兩個(gè)種,羊巴貝斯蟲未定種和莫氏巴貝斯蟲;而莫氏巴貝斯蟲內(nèi)可以分為兩個(gè)亞種,代表株分別為河北株/寧縣株和臨潭株/天祝株。該研究結(jié)果為開展巴貝斯蟲trap基因的功能和厘清我國羊巴貝斯蟲的分類關(guān)系提供了依據(jù)。

2. 以莫氏巴貝斯蟲臨潭株和羊巴貝斯蟲未定種新疆株為研究對象,分別從其cDNA中成功擴(kuò)增trap基因全長,構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET-30a-BLTtrap和pET-30a-BXJtrap,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)和純化重組蛋白rBm TRAP和rBspTRAP,進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和反應(yīng)原性分析。

結(jié)果顯示該基因在大腸桿菌中被正確表達(dá),rBmTRAP和rBsp TRAP大小分別為130ku和110ku;純化后的蛋白濃度分別達(dá)到125μg/m L和100μg/m L。Western-blot和ELISA試驗(yàn)結(jié)果均表明rBspTRAP與rBm TRAP具有良好的反應(yīng)性和特異性,與其他羊梨形蟲和無漿體無交叉反應(yīng);用ELISA測定實(shí)驗(yàn)感染羊的血清中抗TRAP蛋白抗體滴度的試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染后羊體內(nèi)抗TRAP蛋白的抗體滴度較低。結(jié)果表明TRAP可能不適合作為靶標(biāo)蛋白建立羊巴貝斯蟲血清學(xué)檢測方法,也可能是由于本研究并未篩選到ELISA反應(yīng)條件導(dǎo)致,我們將在將來的研究中進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

3. 以6株羊巴貝斯蟲trap基因?yàn)榘谢?設(shè)計(jì)合成三對特異性引物。通過羊巴貝斯蟲PCR試劑盒條件優(yōu)化,建立可用于檢測羊巴貝斯蟲未定種新疆株/敦煌株、莫氏巴貝斯蟲臨潭株/天祝株和莫氏巴貝斯蟲寧縣株/河北株三個(gè)(亞)種蟲株混合感染的多重PCR檢測方法。

該多重PCR方法與其他羊的巴貝斯蟲、泰勒蟲和無漿體無交叉反應(yīng),最低可檢測到10-100pg的羊巴貝斯蟲基因組DNA。以所建的多重PCR方法對實(shí)驗(yàn)室感染的樣品和采自我國甘肅、新疆等9省份的976份野外樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,羊巴貝斯蟲未定種平均陽性率為0.82%,而莫氏巴貝斯蟲的平均陽性率為1.02%。

參考文獻(xiàn)

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