大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、最后通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病均與視網(wǎng)膜血管病理性改變密切相關(guān)。隨著對(duì)視網(wǎng)膜血管性疾病的研究深入，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞是該病變的關(guān)鍵細(xì)胞。通過(guò)體外分離培養(yǎng)原代視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞獲得大量純度高的內(nèi)皮細(xì)胞，可為視網(wǎng)膜血管性疾病研究提供可靠的體外模型收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1.取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2.收集瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞僅留8mL左右培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞傳代

1)吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1)組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常眼組織。
2)細(xì)胞鑒定：血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM-1/CD31）或血管假性血友病因子（vWF）免疫熒光染色為陽(yáng)性。
3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：呈鵝卵石樣，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。1:2傳代大鼠視網(wǎng)膜組織大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、最后通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)。貼壁生長(zhǎng)呈鵝卵石樣，不規(guī)則細(xì)胞樣