雙抗體夾心法人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT用于測(cè)定血清，血漿及相關(guān)液體樣本中表面活性蛋白A(SP-A)相關(guān)含量或活性。人試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被表面活性蛋白A(SP-A)捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的表面活性蛋白A(SP-A)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1、取出試劑盒,室溫(20-25℃)放置30分鐘。

2、分組:取出96孔板,根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔,1個(gè)空白對(duì)照

3、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備小試管6只,依次編好號(hào)碼,先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul,然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號(hào)的試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第二支試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第三只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第四只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第五只試管中,充分混勻;然后在該試管中取100ul,棄掉。第六只試管作為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。

4、加樣:依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中;空白對(duì)照孔加入50ul的蒸餾水;其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標(biāo)記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。

5、溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

6、洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

7、加酶標(biāo)溶液:標(biāo)準(zhǔn)品組、待測(cè)樣本組各孔中加入50ul的酶標(biāo)溶液(空白對(duì)照孔除外)。

8、溫育:酶標(biāo)板用封板紙密封后,放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時(shí)。

9、洗板:用稀釋后的洗滌液注滿每孔,靜置15-30s,充分清洗酶標(biāo)板5次,用吸水紙徹底拍干。

10、顯色:各孔加入顯色劑A液50ul后,再加入顯色劑B液50ul。

11、終止:25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘,加入50ul終止液。

12、讀板:在450nm波長(zhǎng)讀取各孔的OD值。

本試劑盒用于測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中表面活性蛋白A(SP-A)的含量。1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。可檢測(cè)樣本中人的SP-A，且與其類(lèi)似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。表面活性蛋白A(SP-A)也被稱(chēng)為表面活性劑蛋白A1（SP-A1），是一種由SP-A基因編碼的蛋白質(zhì)。它主要在肺部的II型肺泡細(xì)胞中合成，是被稱(chēng)為肺部表面活性劑的脂類(lèi)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分。這種復(fù)合物的功能是降低肺泡的表面張力，防止肺泡在呼氣時(shí)塌陷。表面活性劑的蛋白質(zhì)成分有助于調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程。SP-A1是C型凝集素亞家族的一個(gè)成員，被稱(chēng)為集束蛋白。與SP-A2一起，它們是肺部表面活性劑最豐富的蛋白質(zhì)。SP-A1與一些微生物表面的碳水化合物結(jié)合，有助于防御呼吸道病原體。