重組膠原蛋白性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝
膠原蛋白(collagen) ，又叫膠原質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，主要以不溶性纖維蛋白的形式存在。其廣泛存在于動(dòng)物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中，是結(jié)締組織中極其重要的一種蛋白質(zhì)，占動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25% ～ 30%，起著支撐器官、保護(hù)肌體的功能, 也是組成細(xì)胞間質(zhì)的最重要功能蛋白質(zhì)。
膠原蛋白的種類很多，一般皮膚和骨骼中的是Ⅰ型膠原蛋白，軟骨中的是Ⅱ型膠原蛋白，胚胎皮膚中的是Ⅲ型膠原蛋白，細(xì)胞基底膜中的是Ⅳ型膠原蛋白。
膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，其獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使該分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，且具有低免疫原性和良好的可生物降解性等特征。膠原蛋白作為天然的生物資源，其獨(dú)特的生物相容性和生物可降解性是當(dāng)今合成高分子材料無(wú)法比擬的，另外還有其他特性如高拉伸強(qiáng)度、低免疫性、止血性能以及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等性能。因此，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、化妝品、食品、化工原料與研究等領(lǐng)域。
組成
膠原蛋白的營(yíng)養(yǎng)十分豐富，其富含除色氨酸和半胱氨酸外，同時(shí)還含有在一般蛋白質(zhì)中少見(jiàn)的羥脯氨酸和焦谷氨酸。
1.除了胱氨酸和色氨酸外,膠原蛋白富含18種氨基酸,其中包括7種維持人體必需的氨基酸。
2.膠原蛋白中甘氨酸含量占到將近1/3。
3.膠原蛋白中存在羥賴氨酸和羥脯氨酸,這在其他蛋白質(zhì)中很缺乏。
圖1為膠原蛋白的成分組成
在分子結(jié)構(gòu)上, 膠原蛋白是由平行線型鏈組成,每一線型鏈由三條扭曲左旋的α-肽鏈通過(guò)鏈間相互作用緊密結(jié)合而形成一極強(qiáng)的右旋三重螺旋(triplehelix)結(jié)構(gòu)。每條α-肽鏈由多達(dá)300個(gè)以上的Gly-X-Y三聯(lián)體重復(fù)構(gòu)成, 兩端連接具有不同結(jié)構(gòu)的其它小片段。組成膠原蛋白的氨基酸殘基均為α-氨基酸, 其中X、Y是Gly之外的任何氨基酸殘基, 但X通常是Pro,Y通常是不由DNA堿基密碼子編碼的羥基脯氨酸(Hyp), 它是在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)序列形成之后由特定的酶---脯氨酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase , P4H)作用于序列中的Pro形成的,Hyp羥基通過(guò)分子間氫鍵對(duì)穩(wěn)定膠原螺旋結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用；另外, 還含有一定量的羥賴氨酸(Hyl), 它具有與Hyp相類似的作用。由于Pro 和Hyp 的側(cè)鏈?zhǔn)黔h(huán)形的, 它們的α-碳和酰胺氮之間的鍵不能旋轉(zhuǎn)( 角一般固定在-60°左右), 因此高含量的這些氨基酸殘基促進(jìn)了α-肽鏈螺旋結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定。在三重螺旋結(jié)構(gòu)中,Gly基位于螺旋形的中心, 而其它具有側(cè)鏈的氨基酸殘基位于螺旋的外側(cè)。右旋三重螺旋的螺距為8.55 nm,半徑為1.5nm , 每圈每條肽鏈上包含30個(gè)殘基；而每條左旋肽鏈的螺旋為0.952 nm , 每圈約含3.3個(gè)殘基, 其軸向相鄰氨基酸殘基間的距離大約為0.286nm。由于三重螺旋結(jié)構(gòu)是一種錯(cuò)位的結(jié)構(gòu), 來(lái)自三條肽鏈的Gly 殘基沿著螺旋的中心軸堆積。在三維空間上, 一條鏈上的Gly處于和其它兩條鏈的X 和Y殘基相鄰的位置,A鏈上的Gly與C鏈上的X和B鏈上的Y距離較近。因此,每個(gè)Gly殘基的N-H就與相鄰的X殘基上的CO形成氫鍵。由于Hyp殘基的羥基也參與鏈間氫鍵的形成, 三重螺旋結(jié)構(gòu)得到了穩(wěn)定和增強(qiáng)。有研究表明, 二價(jià)鐵離子存在于膠原多肽的N末端時(shí)可以提高三重螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。另外, 圓二色光譜分析顯示, 多羥基的化合物如糖醇類的物質(zhì)可以與膠原蛋白發(fā)生聚合, 分子力學(xué)計(jì)算進(jìn)一步顯示,這種聚合通常發(fā)生在膠原蛋白三聯(lián)體的X為Ser的位置上,但是膠原蛋白的穩(wěn)定性會(huì)隨著該類化合物碳原子的增加而減弱。
圖2為膠原蛋白的三維結(jié)構(gòu)
膠原蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì), 這取決于兩個(gè)因素, 其一, 膠原每個(gè)肽鏈具有許多酸性或堿性的側(cè)基；其二, 膠原每個(gè)肽鏈的兩端有α-羧基和α-氨基, 這些基團(tuán)都具有接受或給予質(zhì)子的能力, 這些可解離的基團(tuán)在特定的pH值范圍內(nèi), 解離產(chǎn)生正電荷或負(fù)電荷, 換句話說(shuō), 隨著介質(zhì)的pH值不同膠原即成為帶有許多正電荷或負(fù)電荷的離子。膠原肽鏈側(cè)基的PKI值與其組成氨基酸側(cè)基的PKI值略有不同, 這是由于在蛋白質(zhì)分子中受到鄰近電荷的影響所造成的。膠原(牛皮)的等電點(diǎn)是7.5 ～ 7.8, 呈現(xiàn)出偏堿性, 因?yàn)槟z原的肽鏈中堿性氨基酸比酸性氨基酸多一點(diǎn)。膠原是高分子化合物, 在水溶液中具有膠體性質(zhì)和一定粘度, 粘度在等電點(diǎn)時(shí)最低, 而且溫度越低, 粘度越大。
有關(guān)膠原蛋白的組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、應(yīng)用等是由Chemicalbook的東方編輯整理。（2016-01-13）
天然膠原蛋白來(lái)源廣泛，主要存在于動(dòng)物的肌腱、骨、皮膚、韌帶等組織中。目前應(yīng)用較廣的還是以天然獲取的膠原為主，一般從牛、豬、鼠、魚類等動(dòng)物的肌腱、真皮和尾巴中提取[1]。膠原蛋白的提取方法有酸法、堿法、鹽法、酶法等。堿法提取易導(dǎo)致膠原蛋白變性且會(huì)發(fā)生消旋反應(yīng)，一般醫(yī)用膠原蛋白不采用此法。因組織材料中可溶性膠原蛋白含量較少，提取率不高，鹽法提取也較少使用。有研究發(fā)現(xiàn)堿法和鹽法提取的膠原蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，沒(méi)有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。目前，采用酸法和酶法結(jié)合提取膠原蛋白的應(yīng)用較多。酸性溶劑如乙酸等，可使組織溶脹，打開(kāi)其交聯(lián)鍵，利于膠原蛋白的提?。煌瑫r(shí)，酶制劑如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有專一性，可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽，而不改變?nèi)菪Y(jié)構(gòu)。受動(dòng)物疾病如瘋牛病、口蹄疫等影響，魚類等水產(chǎn)類膠原蛋白的研究應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。目前，天然膠原仍是膠原蛋白原料的主要來(lái)源。
人工合成膠原雖然天然來(lái)源的膠原蛋白應(yīng)用廣泛，但其難以修飾，并可能產(chǎn)生致病和免疫不良反應(yīng)及其批次間的差異性問(wèn)題，人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑。重組類人膠原蛋白是采用生物基因工程技術(shù)將膠原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到適合的載體然后轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)得到，具有質(zhì)量可控、加工性強(qiáng)、水溶性好、周期性短、較低排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，常見(jiàn)的宿主表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母菌等。此外，人工化學(xué)合成膠原蛋白也是一種來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)這種人工合成仿生膠原纖維可以黏附和激活血小板，形成凝塊，促進(jìn)愈合，不引起炎癥反應(yīng)，具有作為止血?jiǎng)┑臐摿Α?/p>
提取膠原蛋白的大概過(guò)程是去除油脂，去除雜蛋白，膠原蛋白析出，純化等。它的提取方法有以下幾種：熱水提取法，酸提取法，堿提取和酶提取法。
1.熱水提取法
熱水提取法是將原料經(jīng)過(guò)除雜蛋白等前處理之后，直接在熱水中提取已經(jīng)變性了的膠原蛋白或膠原蛋白水解物的方法，使用的溫度有100℃沸水浴、60-70℃、40-42℃、45℃。
2.酸提取法
酸提取法常用的酸有：甲酸、乙酸、鹽酸、草酸、檸檬酸、乳酸等。低離子濃度酸可以破壞分子間鹽鍵和希夫氏堿，引起膠原纖維膨脹、溶解。
使用酸提取膠原時(shí)，根據(jù)酸濃度、水解溫度、水解時(shí)間等條件的不同，可以得到分子量不均的膠原水解物。但是在等濃度酸徹底水解過(guò)程中色氨酸會(huì)全部被破壞，絲氨酸和酪氨酸也會(huì)部分被破壞。因此，酸法溶出生物醫(yī)用膠原要準(zhǔn)確控制酸度、溫度、時(shí)間等影響因素。
3.堿提取法
堿提取通常使用氫氧化鈉，碳酸鈉等，堿性條件下提取膠原，易引起蛋白質(zhì)變性，如膠原肽鍵水解，含羥基、疏基的氨基酸全部被破壞；所得產(chǎn)物等電點(diǎn)pH值較低，天冬酞胺和谷氨酞胺分別轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼岷凸劝彼?；如果水解?yán)重，則會(huì)產(chǎn)生D、L型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高過(guò)L 型氨基酸，則會(huì)抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突變的作用。因此，在提取結(jié)構(gòu)完整、使用安全的膠原時(shí)，很少采用堿法提取膠原。
4.酶提取法
用蛋白酶處理豬皮，不僅可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率；而且還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保持其優(yōu)良的物理和生化特性。通常使用的蛋白酶主要有中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。影響酶提取的因素有很多，如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實(shí)際操作中，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白。
1.低免疫原性
膠原作為醫(yī)用生物材料, 最重要的特點(diǎn)在于其低免疫原性。膠原有三種類型的抗原分子, 第一類是膠原肽鏈非螺旋的端肽, 第二類是膠原的三股螺旋的構(gòu)象, 第三類是a-鏈螺旋區(qū)的氨基酸順序。其中第二類抗原因子僅存在于天然膠原分子中, 第三類只出現(xiàn)在變性膠原中, 而第一類抗原因子在天然和變性膠原中均存在。
2.生物相容性
生物相容性是指膠原與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用。無(wú)論是在被吸收前作為新組織的骨架, 還是被吸收同化進(jìn)入宿主成為宿主的一部分, 都與細(xì)胞周圍的基質(zhì)有著良好的相互作用, 表現(xiàn)出相互影響的協(xié)調(diào)性, 并成為細(xì)胞與組織正常生理功能整體的一部分。
3.可生物降解性
膠原能被特定的蛋白酶降解, 即生物降解性。因膠原具有緊密牢固的螺旋結(jié)構(gòu), 所以絕大多數(shù)蛋白酶只能切斷其側(cè)鏈, 只有特定的蛋白酶在特定的條件下才能降解膠原蛋白, 膠原肽鍵才會(huì)斷裂。膠原的肽鍵一旦斷裂, 其螺旋結(jié)構(gòu)隨即被破壞, 斷裂的膠原多肽就被蛋白酶徹底水解。
1.在醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中的應(yīng)用
膠原蛋白在組織工程中主要用作支架材料、皮膚和骨骼等。隨著膠原蛋白在組織工程方面的應(yīng)用，生物工程膜的應(yīng)用也更加廣泛，如血管膜、心臟瓣膜以及韌帶等。
膠原蛋白具有良好的生物相容性和可生物降解安全性，可降解吸收，且黏著力好，因而具有獨(dú)特的皮膚修復(fù)功能，其改性后可用于制作皮膚移植材料。膠原蛋白可構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，是細(xì)胞重要的組成成分，對(duì)細(xì)胞起到錨定和支持作用，并可為細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)提供適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，并能提供良好的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。因此，膠原無(wú)論是在被吸收前作為新組織的骨架還是被吸收同化進(jìn)入宿主，成為宿主組織的一部分，都與細(xì)胞周圍的基質(zhì)有著良好的協(xié)調(diào)作用，利于上皮細(xì)胞的增生修復(fù)，從而能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，可用于燒傷、創(chuàng)傷的修補(bǔ)、治療和護(hù)理，可以減輕和緩解燒傷、燙傷的程度。膠原蛋白生物敷料具有兩方面的優(yōu)勢(shì): 一是制備方法簡(jiǎn)便、滅菌方便、易于加工；二是具有黏附性好、適于肉芽組織和上皮細(xì)胞形成、能減少傷口的攣縮和抗原反應(yīng)、止血性能好、易吸收組織溢泌物等特點(diǎn)。
膠原蛋白因其獨(dú)特的特性還可用于眼科疾病的治療。膠原蛋白能夠促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)和細(xì)胞生長(zhǎng)，并可溶解于淚液中，具有引導(dǎo)上皮細(xì)胞潛入缺損區(qū)的能力。同時(shí)它的降解產(chǎn)物能被新生細(xì)胞利用，合成新的膠原，起到連接細(xì)胞的作用。因此，在眼科疾病的治療中應(yīng)用相當(dāng)廣泛。膠原蛋白還可以作為眼睛給藥的載體，具有提高藥物濃度、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、減少藥物的全身藥物毒性的作用，具有廣闊的發(fā)展前景。
膠原蛋白在臨床醫(yī)學(xué)中還被廣泛地用于美容矯形、牙周疾病的治療、硬組織修復(fù)、神經(jīng)的修復(fù)與再生、牙周神經(jīng)修復(fù)包裹材料、人工器官、心臟起搏器、人體內(nèi)臟的充添物等。
2.在化妝品中的應(yīng)用
膠原蛋白可從動(dòng)物皮中提取，動(dòng)物皮中除了含有膠原蛋白外還含有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等蛋白多糖，它們都屬于天然保濕因子，是保持皮膚水分的重要物質(zhì)，而且有阻止皮膚中的酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素的作用。膠原蛋白與皮膚中的膠原結(jié)構(gòu)和皮膚角質(zhì)層相似，能促進(jìn)上皮細(xì)胞的增生和修復(fù)，補(bǔ)充氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，改善皮膚細(xì)胞生存的環(huán)境、促進(jìn)皮膚組織的新陳代謝并增強(qiáng)循環(huán)，使受損和老化的皮膚得到填充和修復(fù)，并具有與皮膚良好的相容性、親和力和滲透性，可被皮膚充分吸收，從而使皮膚豐滿、皺紋舒展，同時(shí)能夠提高皮膚密度，產(chǎn)生張力。故膠原蛋白有純天然保濕、美白、祛斑、防皺等作用，可廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)，如今市場(chǎng)中銷售的面膜、眼霜、護(hù)膚霜等化妝品中很多都含有膠原蛋白。
3.在食品工業(yè)中應(yīng)用
膠原蛋白在食品中有兩方面的應(yīng)用: 一是功能，二是營(yíng)養(yǎng)。膠原蛋白肽可單獨(dú)作為功能性食品直接食用，如咀嚼片、運(yùn)動(dòng)員所需蛋白質(zhì)粉和腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑等。人們食用含膠原蛋白豐富的食品，除了能有效地延緩機(jī)體的衰老、強(qiáng)筋健骨、增強(qiáng)體質(zhì)外，還可起到減肥降壓和補(bǔ)鈣等保健效果。膠原蛋白用特定的酶處理后，可破壞其分子內(nèi)的氫鍵，使其原有的緊密超螺旋結(jié)構(gòu)破壞，所形成結(jié)構(gòu)較為松散的小分子物質(zhì)，加入肉制品中可以改善結(jié)締組織，增加蛋白質(zhì)含量，口感好而且有營(yíng)養(yǎng)。膠原蛋白的酶解產(chǎn)物還可作為冷凍食品的改良劑，用作增黏劑且熔點(diǎn)較低，易于溶化，具有入口即化的特點(diǎn)。因此膠原蛋白廣泛應(yīng)用于果凍、乳酪酸、火腿、罐頭、面包等食品中。另外利用膠原蛋白的成膜性，可將其用作固化酶的膜材料和肉食品標(biāo)簽。膠原蛋白還可作為食品黏合劑合成纖維膜及作為食品保護(hù)層，用作肉類、魚類等的包裝紙，作為食品保護(hù)層，具有抗氧化性而保持肉食品的顏色鮮亮。
4.在其他領(lǐng)域的應(yīng)用
隨著對(duì)膠原蛋白的不斷研究，膠原蛋白在其他領(lǐng)域的應(yīng)用也日益增多且具有良好的發(fā)展前景。如將制革工藝過(guò)程中剩下的廢棄物中含有豐富的膠原蛋白提取出來(lái)，可以用作飼料的動(dòng)物蛋白資源，實(shí)現(xiàn)資源利用。將膠原蛋白經(jīng)變性處理后，可改善其紡織性能而應(yīng)用于紡織工業(yè)。同時(shí)近年來(lái)膠原蛋白在造紙工業(yè)、制革工業(yè)、日用化工業(yè)等輕工業(yè)中也有越來(lái)越多的應(yīng)用。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，對(duì)于膠原蛋白的研究也將繼續(xù)的深入，膠原蛋白也將應(yīng)用得更加廣泛。
化學(xué)性質(zhì)
微黃色片狀凍干物；是皮膚、結(jié)締組織和骨、齒的有機(jī)物的主要成分，不同來(lái)源的膠原蛋白類型不同，但都含有三條α鏈，排列成三層螺旋構(gòu)象，初級(jí)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別形成不同類型，變性后的膠原蛋白稱為明膠。
用途
手術(shù)縫合用纖維，用作測(cè)定膠原蛋白的底物。
生產(chǎn)方法
以牛筋、牛跟腱等為原料，經(jīng)磷酸氫二鈉溶液和KCl溶液抽提，將殘留物經(jīng)水洗、脫水、干燥后得成品。
重組膠原蛋白
上下游產(chǎn)品信息
上游原料
下游產(chǎn)品