人血管生長素(ANG)ELISA KIT性質、用途與生產工藝

檢測類型

雙抗體夾心法

用途

本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中血管生長素(ANG)的含量。

種屬

人

檢測原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人血管生長素(ANG)水平。用純化的血管生長素(ANG)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入血管生長素(ANG)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血管生長素(ANG)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中血管生長素(ANG)含量。 ?

樣本

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。 2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。 3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。 4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。 5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。 7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 ?

操作步驟

1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。 2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。 ? ?

特異性

可檢測樣本中人的ANG，且與其類似物無明顯交叉反應。

背景信息

血管生長素（ANG）也被稱為核糖核酸酶5，是一種123個氨基酸的小蛋白，由ANG基因編碼。血管生長素是通過血管生成過程有效地刺激新血管，它水解細胞RNA，導致蛋白質合成水平的調節(jié)，并與DNA相互作用，導致rRNA表達的啟動子樣增加。另外，它通過血管生成和通過激活抑制細胞凋亡的基因表達與癌癥和神經系統(tǒng)疾病有關。血管生長素也是一種與正常和腫瘤生長中的血管生成有關的關鍵蛋白，它與內皮細胞和平滑肌細胞相互作用，導致細胞遷移、入侵、增殖和形成管狀結構。此外，它與平滑肌和內皮細胞的肌動蛋白結合，形成激活蛋白質分解級聯(lián)的復合物，從而上調蛋白酶和漿蛋白的產生，降解基底膜的層粘連蛋白和纖維蛋白。

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