replication protein A ELISA Kit性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝

用途

本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中復(fù)制蛋白A(RPA-70)的含量。 ?

檢測原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定大鼠標本中復(fù)制蛋白A(RPA-70)水平。用純化的復(fù)制蛋白A(RPA-70)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入復(fù)制蛋白A(RPA-70)，再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的復(fù)制蛋白A(RPA-70)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中復(fù)制蛋白A(RPA-70)含量。 ?

樣本

1、組織標本 對于樣本要求保持鮮重，稱取樣本中的重量不小于50mg，一般以1g為基準,但不嚴格要求固定樣本每個重量必須達到相同的水平。勻漿的比例選取10%，相當(dāng)于1g組織加9ml的勻漿液來進行勻漿。勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。勻漿過程選用組織勻漿器，冰浴上勻漿。(或者進行液氮碾磨)，離心取上清，離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)每分，時間是15分鐘。取上清液待檢。 2-1、貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反 復(fù)凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。 2-2超聲波破碎條件：用20kHz頻率，150W的功率，在冰浴中進行超聲波破碎，每破碎2s，間隔3s，反復(fù)破碎三次。 2-3反復(fù)凍融：收集細胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍，如此反復(fù)3次，可形成細胞裂解液。 3、標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 4、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 ?

操作步驟

1. 標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。 ? ?

replication protein A ELISA Kit 上下游產(chǎn)品信息

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