大鼠內(nèi)皮抑素(ES)ELISA KIT性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝

檢測(cè)類型

雙抗體夾心法

用途

本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中內(nèi)皮抑素(ES)的含量。 ?

種屬

大鼠

檢測(cè)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定大鼠標(biāo)本中內(nèi)皮抑素(ES)水平。用純化的內(nèi)皮抑素(ES)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入內(nèi)皮抑素(ES)，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的內(nèi)皮抑素(ES)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中內(nèi)皮抑素(ES)含量。 ?

樣本

1、組織標(biāo)本 對(duì)于樣本要求保持鮮重，稱取樣本中的重量不小于50mg，一般以1g為基準(zhǔn),但不嚴(yán)格要求固定樣本每個(gè)重量必須達(dá)到相同的水平。勻漿的比例選取10%，相當(dāng)于1g組織加9ml的勻漿液來(lái)進(jìn)行勻漿。勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。勻漿過(guò)程選用組織勻漿器，冰浴上勻漿。(或者進(jìn)行液氮碾磨)，離心取上清，離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)每分，時(shí)間是15分鐘。取上清液待檢。 2-1、貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸并通過(guò)反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。 2-2超聲波破碎條件：用20kHz頻率，150W的功率，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，每破碎2s，間隔3s，反復(fù)破碎三次。 2-3反復(fù)凍融：收集細(xì)胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍，如此反復(fù)3次，可形成細(xì)胞裂解液。 3、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 4、不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。 ?

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 ? ?

特異性

可檢測(cè)樣本中大鼠的ES，且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

背景信息

內(nèi)皮抑素（ES），又叫內(nèi)抑素，是天然存在的20-kDaC端片段，源自XVIII型膠原蛋白。據(jù)報(bào)道，它可以用作抗血管生成劑，類似于血管抑制素和血小板反應(yīng)蛋白。它是一種廣譜血管生成抑制劑，可能會(huì)干擾堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF/FGF-2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等生長(zhǎng)因子的促血管生成作用。它通過(guò)許多影響細(xì)胞活力和運(yùn)動(dòng)的途徑抑制血管生成。它抑制增殖內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞周期控制和抗凋亡基因，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；通過(guò)干擾JNK的TNFα激活來(lái)阻斷由c-JunN末端激酶控制的促血管生成基因表達(dá)；通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白D1來(lái)減少新細(xì)胞的生長(zhǎng)；改變FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)破壞細(xì)胞基質(zhì)粘連、細(xì)胞粘連和細(xì)胞骨架重組來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；通過(guò)結(jié)合內(nèi)切酶α5β1，抑制Ras和Raf激酶的信號(hào)通路并降低ERK-1和p38活性。

大鼠內(nèi)皮抑素(ES)ELISA KIT 上下游產(chǎn)品信息

上游原料

下游產(chǎn)品

大鼠內(nèi)皮抑素(ES)ELISA KIT 生產(chǎn)廠家

 

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