背景及概述[1]
生活在人和動(dòng)物腸道中的埃希氏屬細(xì)菌。該菌外形桿狀，周身具鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，往往在初生兒或動(dòng)物出生數(shù)小時(shí)后即進(jìn)入腸道。除某些菌株能產(chǎn)生腸毒素，使人得腸胃炎外，一般不致病。大腸桿菌能合成對(duì)人體有益的維生素B和維生素K，但當(dāng)人或動(dòng)物機(jī)體的抵抗力下降或大腸桿菌侵入機(jī)體其他部位時(shí)，可引起腹膜炎、敗血癥、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。大腸桿菌生活在人和動(dòng)物腸道中，不生活在水中，如果在水中發(fā)現(xiàn)，說明水被糞便污染。衛(wèi)生學(xué)上常以大腸桿菌作為檢查水源是否被糞便污染的指標(biāo)。
大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)容易，變異容易被檢出，因此是生物學(xué)上的重要實(shí)驗(yàn)材料。大腸桿菌對(duì)于分子遺傳學(xué)的建立和發(fā)展以及生物工程的興起發(fā)揮了重要作用。用大腸桿菌生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子已經(jīng)取得了成功。人的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子是從人腦、腸、胰腺中分泌出來的一種神經(jīng)激素，具有抑制胰島素和胰高血糖素的分泌，對(duì)肢端肥大癥、急性胰腺炎和糖尿病等患者有治療作用。
現(xiàn)在人們通過遺傳工程，把人的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子的基因，引入大腸桿菌，使大腸桿菌按照人們的意愿生產(chǎn)生長(zhǎng)激素釋放抑制因子。這使這種作為藥物的生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)效率大為提高。通過遺傳工程，許多哺乳動(dòng)物的遺傳基因，都可在大腸桿菌上得到表達(dá)。這為人類改造生物開辟了新的途徑。。
檢測(cè)方法[2]
1. 大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)
1)多管發(fā)酵法(MTF，Multiple－tubefermentation)
多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特征，檢測(cè)水樣中大腸菌群的方法。多管發(fā)酵的大腸菌群陽性，如果在44.5℃的培養(yǎng)基上進(jìn)行24h的培養(yǎng)，能釋放出熒光產(chǎn)物而使培養(yǎng)基在紫外光源的照射下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)，此種方法即可檢測(cè)出樣本中是否含有大腸桿菌，具體步驟：取一定量水樣于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(推測(cè)實(shí)驗(yàn))，再進(jìn)行平板分離(證實(shí)實(shí)驗(yàn))復(fù)負(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鑒定(完成實(shí)驗(yàn))。
根據(jù)各稀釋度發(fā)酵的管數(shù)查最可能數(shù)(mostprobablenumber，MPN)表，求得每10mL或每升水樣中的大腸菌群數(shù)。該法方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)的要求和成本低，但是該方法易受其他因素的干擾而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2)濾膜法(MF，membranefilter)濾膜法：是目前最為流行的檢測(cè)水中大腸桿菌群的方法。濾膜法的具體步驟是首先將一定量的水體樣本注入0.45μm的濾膜過濾，經(jīng)過抽濾，水中的細(xì)菌則被留在濾膜上，將濾膜貼于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，溫度為恒溫37℃，這使得菌群因發(fā)酵乳糖而使得濾膜出現(xiàn)紫紅色，通過計(jì)算濾膜上的菌落進(jìn)而計(jì)算出單位樣本中的大腸桿菌的數(shù)量。
用ISO9308－1規(guī)定的濾膜法測(cè)定水中大腸桿菌回收率均值為94.7%，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，檢出限為500mL水樣可檢出1個(gè)CFU。該方法費(fèi)用較低、原理簡(jiǎn)單、利于推廣，但檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、步驟繁瑣、干擾因素多，不適于大量樣品的分析，無法滿足污染物品快速檢測(cè)需求。
3）平板計(jì)數(shù)法(platecount)：該方法是統(tǒng)計(jì)物品含菌數(shù)的有效方法，操作的順序是首先將樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取定量的稀釋液進(jìn)行培養(yǎng)使其逐漸生長(zhǎng)成肉眼可觀察的菌落，然后通過稀釋度和樣本數(shù)量來計(jì)算菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不宜完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞，因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。
2. 大腸桿菌的快速檢測(cè)方法
1）分子生物學(xué)的快速檢測(cè)方法：在分子的水平上通過研究生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來檢測(cè)大腸桿菌。常見方法如下。
A：PCR檢測(cè)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR (polymerasechainreaction)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，擴(kuò)增的一個(gè)周期由高溫變性、低溫退火、適溫延伸等幾步反應(yīng)組成，反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，2～4min即可完成一個(gè)循環(huán)，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。大腸桿菌的檢測(cè)可采用PCR技術(shù)。通過PCR擴(kuò)增UidA能夠檢測(cè)大腸桿菌和志賀氏菌。
B：基因芯片技術(shù)：基因芯片(genechip)技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段。它將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布確定檢測(cè)樣品中特定微生物的存在與豐度。研發(fā)了檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的芯片，并結(jié)合使用免疫生物傳感器，使得檢測(cè)限降低到6×103CFU/mL。
C：DNA探針技術(shù)：DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是一項(xiàng)最新發(fā)展起來的靈敏、特異、快速的檢測(cè)方法，該方法因?yàn)榫哂幸欢ū壤募訇栃苑磻?yīng)，所以所有陽性結(jié)果必須用標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法加以確證。檢測(cè)的主要原理是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，使得單鏈DNA探針僅可以與樣品中變性處理的DNA單鏈出現(xiàn)配對(duì)、雜交，由此決定了制備的探針也具有高度特異性和敏感性
2）免疫分析檢測(cè)技術(shù)：免疫檢測(cè)的基本原理是以抗原與抗體間的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。
A：免疫熒光技術(shù)：IFA免疫熒光技術(shù)是將已知的抗原或者抗體標(biāo)記上不影響其活性的熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體或抗原作為探針來檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。實(shí)際應(yīng)用上，免疫熒光技術(shù)可分為直接法和間接法。直接法是將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)過一定的溫度和時(shí)間的染色，洗去多余熒光抗體，室溫下干燥后封片，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
B：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：ELISA技術(shù)最早出現(xiàn)于19世紀(jì)70年代，它的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。基本原理是把抗原或抗體在預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面，結(jié)合在固相載體表面的抗原或者抗體保持免疫學(xué)活性，測(cè)定時(shí)，將受檢樣本(含待測(cè)抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)，反應(yīng)終止時(shí)，固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復(fù)合物)即與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例，經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì)，加入酶反應(yīng)的底物后，底物即被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定達(dá)到極高的靈敏度。
耐藥性現(xiàn)狀[3]
目前，由于抗生素的濫用導(dǎo)致的大腸桿菌的耐藥性問題已經(jīng)引起了國(guó)際科研和醫(yī)藥界的普遍關(guān)注。大腸桿菌可以依靠外界獲取耐藥基因(ARGs)，加之前期研究證明可以通過水平基因轉(zhuǎn)移(horizontalgenetransfer，HGT)獲得外界耐藥基因變成多重耐藥菌株(multidrugresistantorganisms，MDRO)。目前國(guó)內(nèi)外的研究也均證實(shí)大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，并且耐藥性能變異速度快，且隨著時(shí)間的變化大腸桿菌的耐藥率也逐漸迅速上升，多重耐藥菌株迅速增加，耐藥譜進(jìn)一步擴(kuò)大，對(duì)常用抗生素產(chǎn)生廣譜耐藥性，這無疑增加了大腸桿菌的危害。
抗生素?zé)o節(jié)制的使用加上發(fā)展中國(guó)家對(duì)抗生素管控的落后，大量的抗生素使用所造成的選擇壓力使具有耐藥基因的細(xì)菌逐漸表現(xiàn)出生存優(yōu)勢(shì)。在印度，大腸桿菌幾乎已經(jīng)對(duì)所有可治療的藥物都表現(xiàn)出極高的耐藥性；在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)中，有80%以上的菌株對(duì)三種藥物耐藥，這使得可選擇的治療方法越來越受到限制。目前耐藥菌株幾乎無處不在，對(duì)人體的健康造成巨大危害，在治療疾病的藥物選擇上也造成了巨大的困難。
主要參考資料
[1] 科學(xué)技術(shù)社會(huì)辭典·生物
[2] 大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀的嚴(yán)峻性
[3] 食品中大腸桿菌生物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展