背景[1-3]
人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA KIT應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)水平。收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集?biāo)本，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8℃可保存48小時(shí)，-20℃可保存1個(gè)月。-70度可保存6個(gè)月。部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。用純化的人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)，再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)含量。
人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)是調(diào)節(jié)糖異生的主要控制點(diǎn)。人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)與GTP一起催化草酰乙酸生成磷酸烯醇丙酮酸，并釋放二氧化碳和GDP。人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)表達(dá)可以通過胰島素，糖皮質(zhì)激素，胰高血糖素，cAMP和飲食來調(diào)節(jié)。
應(yīng)用[4][5]
人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA KIT用于磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在腫瘤再生細(xì)胞代謝過程中作用的研究。
采用三維軟纖維蛋白基質(zhì)膠(3D fibrin)分離篩選的腫瘤干細(xì)胞(定義為腫瘤再生細(xì)胞,TRCs)為模型,探究糖異生的關(guān)鍵酶之一的胞漿型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)在黑色素瘤再生細(xì)胞中的表達(dá)及其發(fā)揮的代謝功能。方法：(1)以3D fibrin分離小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞、肝癌H22細(xì)胞、淋巴瘤EL4細(xì)胞中的TRCs,然后使用RT-PCR、Real time PCR和Western blot檢測這些TRCs和相應(yīng)對照細(xì)胞以及小鼠未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)和胚胎干細(xì)胞(mESCs)中PCK1的表達(dá)。(2)使用癌癥基因數(shù)據(jù)庫cbioportal中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析PCK1與CD133、ALDH1A1和ABCG5等常用腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志在多細(xì)胞中的共表達(dá)關(guān)系；并采用Real time PCR檢測PCK1在CD133+與CD133-B16細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異。(3)免疫組化檢測PCK1在9例人黑色素瘤臨床標(biāo)本中的表達(dá)；分離人原代黑色素瘤新鮮標(biāo)本中的TRCs,real time PCR檢測PCK 1的表達(dá)情況。(4)RT-PCR和Western blot檢測B16TRCs中糖異生的另外兩個(gè)關(guān)鍵酶FBP1和G6Pase的表達(dá)情況,以探討PCK1是否介導(dǎo)糖異生的反應(yīng)。(5)以siRNA沉默PCK1的表達(dá)后,觀察B16 TRCs體外生長、葡萄糖消耗、乳酸釋放以及中間代謝產(chǎn)物(如絲氨酸／甘氨酸,三磷酸甘油)等的變化,以探究PCK1發(fā)揮的代謝功能。(6)以siRNA沉默B16或H22 TRCs中PCK1的表達(dá),觀察其在動物體內(nèi)成瘤能力。(7)以siRNA沉默B16 TRCs中PCK1的表達(dá)后,補(bǔ)充相關(guān)中間代謝產(chǎn)物,以觀察對克隆生長的影響。(8)觀察PCK1過表達(dá)對B16 TRCs體外生長的影響。(9)構(gòu)建PCK1啟動子控制的EGFP熒光表達(dá)B16細(xì)胞,分離出該細(xì)胞中的TRCs并置于普通硬質(zhì)環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng),采用熒光顯微鏡動態(tài)觀察熒光變化。
參考文獻(xiàn)
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