背景[1-3]
人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5是指成體骨髓中的一類多能干細(xì)胞。具有分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和其他幾種結(jié)締組織細(xì)胞（如腱細(xì)胞）的潛能，亦可轉(zhuǎn)分化成心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞。
操作流程
1.細(xì)胞收到后建議在培養(yǎng)箱穩(wěn)定4小時(shí)左右再依據(jù)細(xì)胞密度，換液培養(yǎng)或傳代。
2.如果細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，而收到時(shí)呈懸浮或者部分懸浮的狀態(tài)，請(qǐng)將懸浮的細(xì)胞及時(shí)離心，加15%血清的完全培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶中繼續(xù)培養(yǎng)3天；同時(shí)原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細(xì)胞更換為15%血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天。若3天后細(xì)胞都沒有出現(xiàn)增殖而是繼續(xù)脫落死亡，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)人員會(huì)跟進(jìn)解決。
3.貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢：適當(dāng)提高血清濃度（最高不超過(guò)20%），或可根據(jù)該細(xì)胞生長(zhǎng)密度，考慮胰酶消化后，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
4.生長(zhǎng)不均：貼壁細(xì)胞若出現(xiàn)生長(zhǎng)不均，成島狀生長(zhǎng)，可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重新打散細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)傳代流程
1.吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化時(shí)間，通?？刂圃?~2min）。
2.鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁運(yùn)動(dòng)時(shí)（不建議消化到細(xì)胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落、吹散。
3.取出部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4.注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液，待細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時(shí)重復(fù)傳代操作或者凍存。
應(yīng)用[4][5]
用于下調(diào)BMP9表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5相互作用的影響及其機(jī)制研究
探討在人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5構(gòu)成的共培養(yǎng)體系中，用RNAi技術(shù)介導(dǎo)的BMP9基因下調(diào)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞與HS-5細(xì)胞相互作用的影響及其可能涉及的靶基因與信號(hào)通路，從而為尋求乳腺癌治療的新靶點(diǎn)和新藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法：用腺病毒Ad siBMP9感染人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，構(gòu)建內(nèi)源性BMP9表達(dá)下調(diào)的重組細(xì)胞SK-BR-3/Ad siBMP9。采用transwell小室將各組SK-BR-3細(xì)胞分別與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5間接共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分三組（空白組：SK-BR-3+HS-5,co-Blank；對(duì)照組：SK-BR-3/AdRFP+HS-5,co-RFP；實(shí)驗(yàn)組：SK-BR-3/Ad siBMP9+HS-5,co-siBMP9）。
檢測(cè)共培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞生物學(xué)作用的變化：對(duì)各組的SK-BR-3細(xì)胞，增殖變化用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；單個(gè)細(xì)胞集落形成數(shù)變化用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；凋亡變化采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；而SK-BR-3細(xì)胞和HS-5細(xì)胞遷移變化則用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及無(wú)基質(zhì)膠的transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
下調(diào)BMP9表達(dá)后，檢測(cè)共培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞相關(guān)因子mRNA和蛋白水平的變化：RT-PCR檢測(cè)遷移相關(guān)因子（SDF-1，IL-6，MCP-1）變化；Western blot檢測(cè)SDF-1/CXCR4信號(hào)軸變化以及HER2表達(dá)和活化狀態(tài)變化，并檢測(cè)其下游PI3K/AKT，ERK1/2信號(hào)通路的活化狀態(tài)；加入抗SDF-1中和抗體后transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞的遷移變化及Western blot檢測(cè)HER2活化狀態(tài)的改變。
將三組共培養(yǎng)3天的SK-BR-3細(xì)胞和HS-5細(xì)胞按1:1混合后分別注入裸鼠皮下，在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建乳腺腫瘤微環(huán)境模型。
定時(shí)觀察并記錄各組裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)情況，50天后處死裸鼠，取皮下腫瘤移植物做組織切片。用高倍鏡（×400）對(duì)切片進(jìn)行觀察，蘇木精-伊紅染色對(duì)腫瘤細(xì)胞分化情況進(jìn)行觀察，免疫組織化學(xué)染色對(duì)腫瘤增殖，遷移相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀察，TUNEL染色對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)
[1]The HER2 amplicon includes several genes required for the growth and survival of HER2 positive breast cancer cells[J].Kristine Kleivi Sahlberg,Vesa Hongisto,Henrik Edgren,Rami M?kel?,Kirsi Hellstr?m,Eldri U.Due,Hans Kristian Moen Vollan,Niko Sahlberg,Maija Wolf,Anne-Lise B?rresen-Dale,Merja Per?l?,Olli Kallioniemi.Molecular Oncology.2013(3)
[2]Hypoxia-inducible factor-dependent breast cancer-mesenchymal stem cell bidirectional signaling promotes metastasis[J].Chaturvedi,Pallavi,Gilkes,Daniele M,Wong,Carmen Chak Lui,Kshitiz,Luo,Weibo,Zhang,Huafeng,Wei,Hong,Takano,Naoharu,Schito,Luana,Levchenko,Andre,Semenza,Gregg L.Journal of Clinical Investigation.2013(1)
[3]Molecular mechanisms mediating metastasis of hypoxic breast cancer cells[J].Gregg L.Semenza.Trends in Molecular Medicine.2012(9)
[4]Adenovirus-mediated overexpression of BMP-9 inhibits human osteosarcomacell growth and migration through downregulation of the PI3K/AKT pathway[J].Bo Li,Yuehua Yang,Shengdan Jiang,Binbin Ni,Ke Chen,Leisheng Jiang.International Journal of Oncology.2012(5)
[5]陳瑩瑩.下調(diào)BMP9表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5相互作用的影響及其機(jī)制研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2014.