背景[1-3]
RS1細胞是大鼠皮膚成纖維樣細胞來源于一大鼠的皮膚組織。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
體外培養(yǎng)的成纖維細胞多為梭形、多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達的高爾基復合體。處于成熟期或稱靜止狀態(tài)的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體均不發(fā)達。它具有較強的分裂增殖能力，適應性強，是最容易培養(yǎng)的動物細胞類型之一。
成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，細胞呈梭形或扁的星狀，具有突起。根據(jù)不同的功能活動狀態(tài)，將細胞分為成纖維細胞和纖維細胞二型。
成纖維細胞是功能活動旺盛的細胞，細胞和細胞核較大，輪廓清楚，核仁大而明顯，細胞質(zhì)弱嗜堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動；處于成熟期或稱靜止狀態(tài)的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體均不發(fā)達，被稱為纖維細胞。
纖維細胞功能活動不活躍，細胞輪廓不明顯，核小著色深，核仁不明顯，細胞質(zhì)少。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細胞，其功能活動也得以恢復，參與組織損傷后的修復。
應用[4][5]
用于PAI-1-RNAi對SD大鼠皮膚成纖維細胞增殖的影響研究
應用RNA干擾（RNA Interference,RNAi）技術下調(diào)纖溶酶原激活抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1）表達對SD大鼠皮膚成纖維細胞（fibroblast）增殖的影響,通過體外實驗從細胞水平探究PAI-1對成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)化的作用,進一步為前期動物實驗PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù),為瘢痕疙瘩（keloid）基因治療開辟新思路。
方法:1 SD大鼠皮膚成纖維細胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細胞,經(jīng)傳代培養(yǎng)去除上皮細胞、紅細胞等雜質(zhì)成分,獲取單一成纖維細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)變化。
2免疫細胞化學法鑒定細胞應用免疫細胞化學法,通過檢測波形蛋白表達是否陽性,鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為成纖維細胞。
3 PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的成纖維細胞,并進行實驗分組利用脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）轉(zhuǎn)染siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染不同設置實驗分組為:轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA的實驗組、轉(zhuǎn)染NC siRNA的陰性對照組、不進行轉(zhuǎn)染的空白對照組。
4應用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染24小時,PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表達。
5應用Western blot法測定轉(zhuǎn)染48小時,PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表達。
6應用臺盼藍染色法計數(shù)細胞并繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時、48小時、72小時,制備細胞懸液進行臺盼藍染色,鏡下計數(shù)細胞總數(shù)以及未被染液染色的細胞總數(shù)（或被染色的細胞總數(shù)）,以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞計數(shù)為縱坐標,繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞成活率曲線。
7應用CCK-8測定成纖維細胞的增殖活力繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時、48小時、72小時加入CCK-8試劑,孵育4小時后,通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度（OD值）,根據(jù)計算公式,得出細胞的OD值、細胞增殖抑制百分率（%）。以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞的OD值為縱坐標繪制生長曲線;以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞增殖抑制百分率（%）為縱坐標繪制增殖抑制率曲線。
8統(tǒng)計學處理本實驗所有數(shù)據(jù)應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,實驗數(shù)據(jù)為計量資料,采用均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計結果以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
參考文獻
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