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SH-SY5Y細胞的應用

2021/2/2 9:33:33

背景[1-3]

SH-SY5Y細胞來源于1970年建立的一神經(jīng)母細胞瘤患者的轉(zhuǎn)移骨瘤灶細胞SK-N-SH經(jīng)三次克隆后的亞系(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)。該細胞顯示中等水平的多巴胺-β-羥基酶活性。SH-SY5Y細胞的生長密度可高達1X106細胞/cm2,生長成懸浮和貼壁混合生長,有的聚集成細胞叢。

顯微鏡下,神經(jīng)母細胞瘤呈現(xiàn)為藍染的小圓形細胞,菊花形排列。腫瘤細胞圍繞神經(jīng)氈(neuropil)呈菊花形排列,與其他的腫瘤(如視神經(jīng)母細胞瘤)圍繞血管呈菊花形排列有所不同。其他還有一些神經(jīng)母細胞瘤所特異的免疫組化染色,用以與其他腫瘤(尤因肉瘤,淋巴瘤等)進行鑒別診斷。

細胞培養(yǎng)方法:

1、細胞傳代:細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆蓋整個瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;

③1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化;若細胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;

⑥懸浮細胞直接離心收集,細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇:

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補加適量培養(yǎng)基。

應用[4][5]

用于PARP-1依賴性程序性細胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細胞損傷中作用的研究

應用SH-SY5Y細胞培養(yǎng)技術,通過檢測細胞內(nèi)PARP-1的表達、PAR含量變化及細胞內(nèi)NAD+水平的變化,初步明確布比卡因所致的神經(jīng)毒性中是否存在Parthanatos;同時通過外源性NAD對布比卡因所致的細胞內(nèi)ROS含量增加、線粒體膜電位降低、細胞核損傷及細胞凋亡的影響,確定外源性NAD是否有助于減輕布比卡因的神經(jīng)毒性。

其目的在于從新的角度探討在布比卡因神經(jīng)毒性的機制,為臨床上防治局麻藥的神經(jīng)毒性提供實驗依據(jù)。第1章布比卡因神經(jīng)毒性是否與多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)激活有關目的明確布比卡因是否導致SH-SY5Y細胞PARP-1激活,其神經(jīng)毒性是否與激活PARP-1有關。

方法以1-10mM布比卡因培養(yǎng)液處理SH-SY5Y細胞30分鐘-6小時,以Western-blot法檢測細胞內(nèi)PARP-1及其代謝產(chǎn)物-多聚腺苷二磷酸核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)的表達情況;以100nM、200nM的PARP-1抑制劑-PJ34培養(yǎng)液與5mM布比卡因培養(yǎng)液共同處理細胞30分鐘,或單獨以5mM布比卡因處理細胞30分鐘,光鏡下觀察其對布比卡因所致細胞形態(tài)改變的影響,并以CCK-8法其對細胞存活率的影響。

計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同濃度布比卡因處理30分鐘后細胞內(nèi)PARP-1及PAR的表達、1mM布比卡因處理0-6小時后細胞內(nèi)PAPR-1及PAR的表達采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊);PJ34對布比卡因處理后細胞存活率的影響采用兩因素析因設計資料方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊)。

參考文獻

[1]Glutathione synthesis and its role in redox signaling[J].Hongqiao Zhang,Henry Jay Forman.Seminars in Cell and Developmental Biology.2012(7)

[2]Bupivacaine induces apoptosis via mitochondria and p38 MAPK dependent pathways[J].Jun Lu,Shi yuan Xu,Qing guo Zhang,Rui Xu,Hong yi Lei.European Journal of Pharmacology.2011(1)

[3]Ropivacaine Versus Bupivacaine for Epidural Labor Analgesia[J].Yaakov Beilin,Stephen Halpern.Anesthesia&Analgesia.2010(2)

[4]PARP inhibitors:New tools to protect from inflammation[J].Vincenzo Giansanti,Francesca Donà,Micol Tillhon,A.Ivana Scovassi.Biochemical Pharmacology.2010(12)

[5]鄭艇.PARP-1依賴性程序性細胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細胞損傷中作用的研究[D].南方醫(yī)科大學,2014.

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