背景[1-3]
SDS細胞裂解液是一種比較強烈的細胞組織裂解液，通過陰離子去垢劑SDS促進細胞膜的崩解，特別適用于膜蛋白或者細胞骨架蛋白等難溶蛋白的溶解，有利于膜蛋白，胞漿蛋白、核蛋白、胞漿磷酸化蛋白及細胞核轉錄因子的提取。
SDS細胞裂解液具有有強烈的蛋白變性作用，不能用于非變性蛋白方面的研究。本產品裂解得到的蛋白樣品可用于常規(guī)的Western、染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)等。
蛋白檢測膠圖
使用方法：
1.對于培養(yǎng)細胞樣品
(1)融解SDS細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。
(2)細胞裂解
對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1~2秒后，細胞就會被裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10 min。
對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。如果細胞量較多，必需分裝成50~100萬細胞/管，然后再裂解。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10分鐘。
(3)充分裂解后，10000~14000rpm離心3~5 min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和ChIP等操作。
2.對于組織樣品：
(1)把組織剪切成細小的碎片。
(2)融解SDS細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
(3)按照每20毫克組織加入150—250μL裂解液的比例加入裂解液，如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。具體SDS細胞裂解液的用量參照表1。
(4)用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解10分鐘。
(5)充分裂解后，10000~14000 rpm離心3~5 min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和ChIP等操作。
應用[4][5]
用于組蛋白變異體H2A.X在卵母細胞裂解液逆轉化小鼠胎兒成纖維細胞（MEFs）成為誘導性多能干細胞（iPSC）中的作用研究
過體外獲取小鼠卵母細胞,制備卵母細胞裂解液,利用其中含有的重編程因子,將不同濃度的卵母細胞裂解液（20個/20μl、30個/20μl、40個/20μl、50個/20μl和60個/20μl）與經過適宜濃度鏈球菌溶血素O（streptolysin O,SLO）（25U）滲透化處理的第三代MEFs共孵育,以研究不同濃度的卵母細胞裂解液對MEFs重編程的影響。然后,通過在卵母細胞裂解液重編程中添加單一的表觀遺傳修飾因子TSA或5-Aza-dC和同時添加TSA、5-Aza-dC兩種因子,觀察不同處理之間重編程效率的差異,旨在優(yōu)化卵母細胞裂解液重編程體細胞的體系,提高重編程效率,減少重編程時間。
結果表明:當卵母細胞裂解液濃度為40個/20μl、50個/20μl和60個/20μl時,iPSCs的集落數(shù)（分別為24±1.25個、23.88±0.47個和22±1.63個）極顯著高于20個/20μl和30個/20μl處理組的集落數(shù)（分別為11.33±1.7個和17±0.82個）（P<0.01）,而卵母細胞裂解液濃度為40個/20μl、50個/20μl以及60個/20μl時所形成的ipscs集落數(shù)差異不顯著（p>0.05）;當在卵母細胞裂解液重編程基礎上同時添加了tsa和5-aza-dc時,ipscs集落數(shù)（35.88±0.77個）顯著高于只添加一種表觀遺傳修飾因子tsa或5-aza-dc的集落數(shù)（分別為29±1.45個、30±0.98個）（p<0.05）。
因此,在卵母細胞裂解液濃度為40個/20μl、50個/20μl和60個/20μl重編程效率差異不大的情況下,宜采用40個/20μl卵母細胞裂解液重編程mefs,同時,為了提高重編程效率,縮短時間,添加表觀遺傳修飾因子tsa和5-aza-dc能更大程度的提高卵母細胞裂解液重編程的效率。
參考文獻
[1]Histone Variant H2A.X Deposition Pattern Serves as a Functional Epigenetic Mark for Distinguishing the Developmental Potentials of iPSCs[J].Tao Wu,Yifei Liu,Duancheng Wen,Zito Tseng,Martik Tahmasian,Mei Zhong,Shahin Rafii,Matthias Stadtfeld,Konrad Hochedlinger,Andrew Xiao.Cell Stem Cell.2014
[2]Histone Variant H2A.Bbd Is Associated with Active Transcription and mRNA Processing in Human Cells[J].Michael Y.Tolstorukov,Joseph A.Goldman,Cristele Gilbert,Vasily Ogryzko,Robert E.Kingston,Peter J.Park.Molecular Cell.2012(4)
[3]Histone tyrosine phosphorylation comes of age[J].Rakesh Kumar Singh,Akash Gunjan.Epigenetics.2011(2)
[4]Stepwise Histone Replacement by SWR1 Requires Dual Activation with Histone H2A.Z and Canonical Nucleosome[J].Ed Luk,Anand Ranjan,Peter C.FitzGerald,Gaku Mizuguchi,Yingzi Huang,Debbie Wei,Carl Wu.Cell.2010(5)
[5]楊波.組蛋白變異體H2A.X在卵母細胞裂解液逆轉化小鼠胎兒成纖維細胞(MEFs)成為誘導性多能干細胞(iPSC)中的作用研究[D].西南大學,2016.