背景[1-3]
PCR純化試劑盒采用便捷離心柱形式的專有硅膠膜技術(shù)，無(wú)需使用昂貴的樹脂或有毒的苯酚-氯仿提取。它可有效去除PCR和其他反應(yīng)混合物中的引物、dNTP、未摻入的標(biāo)記核苷酸、酶和鹽。該試劑盒可用于純化25 bp至20 kb的DNA片段，回收率高達(dá)100%。每個(gè)純化柱的總結(jié)合能力高達(dá)25µg DNA，全過(guò)程只需5分鐘。純化得到的DNA可用于常見下游應(yīng)用，包括測(cè)序、限制性酶切、標(biāo)記、連接、克隆、體外轉(zhuǎn)錄、印跡或原位雜交等。
PCR純化DNA膠圖
操作步驟：
1、在PCR反應(yīng)液中直接加入5倍體積的PB液，顛倒混勻后，全部加入到吸附柱CA2中，10000g離心30-60秒，到掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2重新放入收集管中。
2、向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，10000g離心30-60秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。
3、向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，10000g離心30-60秒，倒掉廢液。
4、將離心吸附柱CA2放回收集管中，10000g離心2分鐘，盡量除去漂洗液。
5、將吸附柱放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。10000g離心2分鐘收集DNA溶液。
應(yīng)用[4][5]
用于rhIL-24、EGCG對(duì)肺癌生長(zhǎng)和腫瘤血管生成抑制的基礎(chǔ)研究
構(gòu)建新的pET-21a-IL-24重組質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng),并在大腸桿菌中獲得穩(wěn)定的高效表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物純化、復(fù)性后得到部分純化人重組白細(xì)胞介素24（rhIL-24）蛋白。
檢測(cè)其刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分泌細(xì)胞因子的生物學(xué)活性,觀察其在體內(nèi)外對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)、凋亡效應(yīng)以及抗腫瘤血管生成作用。為原核表達(dá)IL-24蛋白重組藥物的研制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。茶多酚主要成分EGCG也具有高效無(wú)毒的抗腫瘤特性,實(shí)驗(yàn)擇其與IL-24進(jìn)行比照研究。
方法:以pBV220-IL-24載體為模板,以上游含有BamHI酶切位點(diǎn),下游含有XhoI酶切位點(diǎn)的hIL-24引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將pET-21a（+）質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物雙酶切后用膠回收試劑盒回收目的片段,再連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定重組子后測(cè)序。
將測(cè)序正確的pET-21a（+）-IL-24重組質(zhì)粒抽提后轉(zhuǎn)化BL21菌株,挑取陽(yáng)性克隆。振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。接種LA培養(yǎng)基,搖菌至OD600≈0.40.6時(shí),加入IPTG,經(jīng)誘導(dǎo)不同時(shí)間（2、3、4、5小時(shí)）后,分別取樣。
離心取菌體,超聲破碎,將包涵體進(jìn)行洗滌,溶包,復(fù)性后透析,獲得部分純化rhIL-24蛋白,Western-blotting方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。用ELISA法檢測(cè)rhIL-24蛋白刺激PBMC分泌IL-6、IFN-γ和TNF-α的活性。
用MTT法評(píng)價(jià)rhIL-24、EGCG對(duì)A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,獲得rhIL-24和EGCG的半數(shù)細(xì)胞抑制所需藥物濃度值（IC50）。
通過(guò)FCM檢測(cè)rhIL-24和EGCG對(duì)A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期和凋亡的影響。觀察rhIL-24和EGCG對(duì)雞胚尿囊膜（CAM）微血管生成的影響。
在建立的人肺癌裸鼠移植瘤模型上觀察rhIL-24和EGCG對(duì)瘤體生長(zhǎng)的抑制作用,用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中CD34和NF-κB的表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
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[3]A brassinosteroid transcriptional network revealed by genome‐wide identification of BESI target genes in Arabidopsis thaliana[J].XiaofeiYu,LeiLi,JaroslawZola,ManeeshaAluru,HuaxunYe,AndrewFoudree,HongqingGuo,SarahAnderson,SrinivasAluru,PengLiu,SteveRodermel,YanhaiYin.The Plant Journal.2011(4)
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[5]朱曄涵.rhIL-24、EGCG對(duì)肺癌生長(zhǎng)和腫瘤血管生成抑制的基礎(chǔ)研究[D].蘇州大學(xué),2005.