背景[1-3]
檢定培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。
檢定培養(yǎng)基指一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找到目的菌菌落的培養(yǎng)基。
檢定培養(yǎng)基用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。
檢定培養(yǎng)基
幾種細(xì)菌由于對(duì)培養(yǎng)基中某一成分的分解能力不同,其菌落通過指示劑顯示不同的顏色而被區(qū)分開,這種起鑒別和區(qū)分不同細(xì)菌作用的培養(yǎng)基,叫檢定培養(yǎng)基。
一類只須憑肉眼辨別顏色等鮮明特征就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。
其作用原理主要是在培養(yǎng)基中含有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑。最常見的如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)，它在飲用水、牛奶、飲料和食品等的大腸菌群數(shù)檢測(cè)以及在大腸埃希氏菌的遺傳學(xué)等研究工作中，有著重要的應(yīng)用。改良后的EMB培養(yǎng)基成分是(%)：蛋白胨1，乳糖0.5，蔗糖0.5，伊紅Y0.04，美藍(lán)0.0065；最終pH=7.2。
應(yīng)用[4][5]
用于恩拉霉素生產(chǎn)菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究
恩拉霉素（enramycin）是放線菌（Streptomyces fungicidious）分泌的,由不飽和脂肪酸與十幾種氨基酸結(jié)合的多肽類抗生素。主要成分為恩拉霉素A和恩拉霉素B,還含有少量的恩拉霉素C和D。恩拉霉素對(duì)革蘭氏陽性菌有良好的抗菌作用,通過抑制其細(xì)胞壁前聚物質(zhì)的合成來影響生物體,特別是對(duì)腸內(nèi)的有害梭狀芽孢桿菌（Clostridium）抑制力很強(qiáng)。因其能起到良好的促生長(zhǎng)作用,目前作為飼料添加劑使用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。
對(duì)Streptomyces fungicidious KS010菌株發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素進(jìn)行了初步研究,主要包括恩拉霉素測(cè)定方法的建立、高產(chǎn)恩拉霉素菌株的選育、恩拉霉素發(fā)酵條件的優(yōu)化及上罐培養(yǎng)等內(nèi)容。
首先優(yōu)化了恩拉霉素的微生物檢定法和高效液相色譜法的檢定條件,建立了測(cè)定恩拉霉素的微生物檢定法和高效液相色譜法（HPLC）標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過浸提溶液組成、浸提時(shí)間、檢定菌濃度考察,優(yōu)化了微生物檢定法的檢定條件。
在檢定條件為丙酮浸提液B（丙酮：2mo1/L鹽酸：水=20：1：21）、浸提時(shí)間80min、檢定菌濃度106個(gè)/mL的情況下,建立恩拉霉素微生物檢定法標(biāo)準(zhǔn)曲線。恩拉霉素濃度在0.56-35.79U/mL之間,其濃度的對(duì)數(shù)值與相應(yīng)的抑菌圈直徑呈直線相關(guān)；回歸方程為Y=0.2436X-3.47436,相關(guān)系數(shù)r為0.9960。通過流動(dòng)相配比、流速和浸提時(shí)間的考察,優(yōu)化了HPLC的檢定條件。
在色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)267nm,流動(dòng)相為乙腈：50mM KH2PO4（30:70）,流速為0.8mL/min的情況下,建立恩拉霉素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。恩拉霉素濃度在0.26-275.72U/mL范圍內(nèi),得到的回歸方程Y=1.83099E-6X-0.52846,相關(guān)系數(shù)r為0.99947。采用同種樣品,對(duì)兩種測(cè)定方法進(jìn)行比較,所得結(jié)果重復(fù)性好,準(zhǔn)確性高,都可用于含恩拉霉素的樣品測(cè)定。
對(duì)出發(fā)菌株（Streptomyces fungicidious KS010）進(jìn)行NTG誘變、通過瓊脂塊法進(jìn)行初篩,獲得M-19菌株,產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高32.62%。接著以該菌株為研究對(duì)象,比較了紫外復(fù)合誘變和60Co-Y復(fù)合誘變的效果,結(jié)果表明60Co-γ復(fù)合誘變優(yōu)于紫外復(fù)合誘變。
從60Co-γ復(fù)合誘變正變株中獲得一株搖瓶效價(jià)達(dá)1853U/mL,較出發(fā)菌株提高68.00%的菌株。通過繼代培養(yǎng),該菌株穩(wěn)定性好,命名為Streptomyces fungicidious Co250-42。通過單因素試驗(yàn)和中心組合響應(yīng)面優(yōu)化分析考察了影響Streptomyces fungicidious KS010菌株產(chǎn)恩拉霉素的因素,得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素的條件。