基因敲除小鼠已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學基礎研究和藥物研發(fā)領域不可或缺的實驗動物模型，在生命科學、人類醫(yī)藥和健康研究領域中發(fā)揮著重要的作用?；谂咛ジ杉毎幕虼虬屑夹g、EGE技術（基于Crispr cas9技術）是當下比較火熱的基因敲除小鼠制備技術。利用這兩種技術制備基因敲除小鼠的流程是什么樣的？

一、基于胚胎干細胞的基因打靶技術制備基因敲除小鼠的流程：

1、課題設計，訂購課題BAC菌；

2、按照課題設計，完成打靶載體設計和構建；

3、將重組載體電轉到胚胎干細胞中，用G418篩選轉染后的胚胎干細胞，得到陽性克??；

4、進一步通過PCR和southern blot雜交技術（基因敲除小鼠檢測金標準）對上一步得到的陽性克隆進行篩選，得到穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細胞陽性克??；

5、將胚胎干細胞陽性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內；

6、得到嵌合鼠，并獲得F1陽性雜合子小鼠。

基于胚胎干細胞的基因打靶技術制備基因敲除小鼠是目前為止唯一一個可以滿足幾乎所有基因組修飾要求的打靶技術，但目前只應用在小鼠的基因敲除上，而且其周期長工作量大。

二、利用EGE技術（基于Crispr cas9技術）制備基因敲除小鼠的流程：

設計構建識別靶序列的sgRNA;

設計構建致靶基因切割的EGE系統(tǒng)載體質粒；

利用百奧賽圖自主開發(fā)的UCA試劑盒對sgRNA/Cas9進行活性檢測；

設計構建打靶載體；

體外轉錄sgRNA/Cas9 mRNA;

小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶載體；

獲得Fo代小鼠，利用PCR對Fo代小鼠進行基因型鑒定；

獲得F1代小鼠，利用PCR和southernblot雜交技術（基因敲除小鼠檢測金標準）對F1代小鼠進行基因型鑒定。

雖然EGE技術（基于Crispr cas9技術）制備基因敲除小鼠看似比基于胚胎干細胞的基因打靶技術制備基因敲除小鼠流程繁瑣，其實不然，EGE技術（基于Crispr cas9技術）系統(tǒng)構建簡單，基因敲除/敲入效率高，速度快，可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，最快2個月即可得到F0代陽性鼠，5個月得到F1代雜合子小鼠。