背景^[1]

熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來源于嗜冷海洋細菌經(jīng)大腸桿菌表達純化的的重組蛋白，又稱南極熱敏UDG。該UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶，產(chǎn)生的缺嘧啶位點，在高溫或高 pH 下，極易水解斷裂。該酶對RNA無活性，主要用于PCR擴增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱，經(jīng)95℃10min處理仍會殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，導致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。

而來源于嗜冷海洋細菌的熱敏型UDG在50℃ 5min即完全失活，在進行PCR擴增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃10min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性）在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活，因此不會影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。

應用^[1]

尿嘧啶糖基化酶在D P 防污染中的應用

熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶可用于去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基，也可以去除 PCR 殘存污染。在PCR 操作過程中，最容易出現(xiàn)污染” 問題，原因主要有如下幾種情況：

①模板的交叉污染：在樣品采集或處理中，氣溶膠、加樣器取樣時的泡沫或其他原因引起樣品或模板的交叉污染，造成假陽性，屬于正常DNA 由A、T、G、C 四種堿基組成引起的污染；

② 擴增產(chǎn)物的污染：在擴增過程中，將堿基T 置換成U，使得擴增產(chǎn)物為U-DNA (由A、U、G、C四種堿基組成)，由于產(chǎn)物量特別大，容易溢漏引起污染，造成假陽性；

③ 核酸酶、蛋白酶的污染造成假陰性；在這三種情況中最為嚴重是第二種，即稱之為“ 殘留污染” ，因為PCR 擴增的放大倍數(shù)高達千萬倍，而且在實際應用中擴增一直在反復進行，造成擴增產(chǎn)物的大量堆積，難于將其控制降解，即使是熒光PCR 也很難避免擴增產(chǎn)物的污染，為了使得PCR 結(jié)果更加可靠、準確，有必要在反應管完全封閉后于管內(nèi)通過酶或其他方法，將操作過程中可能帶人的殘留污染物破壞，使其不能成為新一輪擴增的模板，從UDG 的生物學性質(zhì)可知，它是完成這一任務的選擇。

從生物學特性來看，UDG 是一種常見的DNA 修復酶之一，具有DNA 糖苷酶的一般特性—不依賴鎂離子、球蛋白、分子量小，能夠特異地作用于DNA 分子中的尿嘧啶殘基，不能作用于游離的尿嘧啶核苷、RNA 和四種正常的核苷酸等，在DNA 修復中起重要作用。

作用原理^[1]

大腸桿菌熱敏尿嘧啶DNA糖基化酶( UDG 也有些文章簡寫為UNG ) 是PCR 防污染應用最廣泛的酶之一，由UNG基因編碼；該基因位于染色體5 分鐘處，全基因長750bP，含有一個ORF，其長度為678b p，編碼229 個氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量為25，66 4Da；PCR 防污染正是利用了UDG在DNA 修復過程中的生物學特性，下面是UDG 作用于含尿啥吮的DNA ( U-DNA ) 的化學圖解(圖1) 和P CR 防污染的示意圖(2)：

由圖一可以看出，在適宜的條件下，UDG 能特異地識別DNA 分子中出現(xiàn)的鳥嘧啶核苷，并將其切割下來，形成自由的尿嘧啶，在DNA 除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的無堿基“空洞”即脫嘌呤嘧啶位點，在加熱或堿性條件下，DNA 在“ 糖一磷酸骨架”處斷裂，這就是UDG 水解含尿嘮吮DNA 的化學原理。

在圖二中首先可以看到，由正常堿基A、T、G、C 構成的正常DNA，可以通過PCR 反應，用dUTP 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的d竹P 擴增出大量含有尿嚓吮的DNA ( U-DNA )，是熱敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物；當擴增產(chǎn)物作為“殘留污染物”時，它能通過UDG 的水解作用產(chǎn)生脫嘧啶嘌呤位點，該位點當進行PCR 預變性時DNA 鏈在這些位點發(fā)生斷裂，失去模板的功能，同時，通過預變性能夠?qū)⒎磻w系中的UDG 滅活，一方面有效的防止了“ 殘留污染物”對PCR 反應帶來的污染，達到預防污染的目的，另一方面又有效地保護了新生擴增產(chǎn)物，完成新的PCR 擴增。

主要參考資料

[1] 李振勇, 劉明霞. 尿嘧啶 DNA 糖基化酶在 PCR 防污染中的應用[J]. 中國醫(yī)藥導刊, 2001, 3(4): 305-306.