背景^[1-3]

硬組織線粒體分離試劑盒是快速便捷分離組織中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時(shí)可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測(cè)線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞活動(dòng)所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化所產(chǎn)生的能量來供應(yīng)。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級(jí)分離法獲得，即先低俗出去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片，再進(jìn)行高速梯度離心分離線粒體。

硬組織線粒體分離試劑盒

操作步驟：

1、清洗：取新鮮組織(不宜采用凍存的組織)，迅速稱重50～100mg，用預(yù)冷的PBS清洗1次，冰上剪成3mm2大小的組織碎片。

2、勻漿裂解：加入10倍體積的預(yù)冷的Mitochondria Lysis buffer(如需獲得細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)提前加入PMSF，至PMSF濃度為1×)，置于冰浴上Dounce勻漿器中，勻漿10～20次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

3、離心：4℃，600g離心5min以去除細(xì)胞核、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。

4、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃12000g離心10min。

5、棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時(shí)注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12000g，4℃離心10min，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。

6、保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于Mitochondria Stock buffer。

應(yīng)用^[4][5]

用于玉米同核異質(zhì)及同質(zhì)異核雄性不育系線粒體基因組比較分析研究

實(shí)驗(yàn)以兩套同核異質(zhì)材料C48-2、48-2,C黃早四、黃早四和一套同質(zhì)異核玉米材料C48-2、C黃早四、C698-3、C478作為研究對(duì)象。通過蔗糖襯墊法分離玉米線粒體并提取其DNA,采用IlluminaHiseq2500平臺(tái)對(duì)玉米線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序分析,利用Denovo組裝和Gap內(nèi)洞拼接得到完整線粒體基因組序列,進(jìn)而分析兩套同核異質(zhì)玉米線粒體基因組間的差異,挖掘細(xì)胞質(zhì)雄性不育的候選基因;通過同質(zhì)異核材料間細(xì)胞質(zhì)基因組的生物信息學(xué)分析,探究核質(zhì)互作對(duì)細(xì)胞質(zhì)基因組的影響。

本研究所得主要結(jié)果如下:1.C48-2、C黃早四、C698-3、C478和48-2、黃早四線粒體基因組測(cè)序數(shù)據(jù)過濾后均大于1GB?；蚪M組裝結(jié)果分別為739,660bp（C48-2）、739,653bp（C黃早四）、739,607bp（C478）、739,643bp（C698-3）和566,154bp（48-2）、566,503bp（黃早四）,GC含量均約為44%。C48-2、C黃早四、48-2和黃早四葉綠體基因組的組裝結(jié)果分別為140,473bp（C48-2）、140,478bp（C黃早四）、140,458bp（48-2）、140,448bp（黃早四）,GC含量均為38.4%。

2. 通過6個(gè)供試材料線粒體基因組的序列同源性和共線性比較,發(fā)現(xiàn)C型不育系和保持系（48-2、黃早四）線粒體基因組保守區(qū)域共線性較高,但這些保守序列段的排列順序及方向存在差異。C型不育系線粒體基因組中存在總長(zhǎng)約為241kb的大片段重復(fù)序列,而可育材料中的大片段重復(fù)序列較少,簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）的檢索結(jié)果也顯示,線粒體基因組中存在大量的五、六堿基單元的重復(fù)序列,且不育材料比可育材料中數(shù)量更多。

3. 六個(gè)材料線粒體基因組均注釋到33個(gè)已知蛋白編碼基因,對(duì)這些基因的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)nad4L、cob、cox3、atp9、rps4基因在不同細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組中的拷貝數(shù)存在差異;atp4、atp6、cox2、nad2、rps2B基因在不同細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組中的基因序列信息存在差異。通過預(yù)測(cè)這些差異基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域并進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)部分堿基序列的變異可造成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,并引發(fā)其功能的改變。

4. 兩套同核異質(zhì)玉米葉綠體基因中均注釋到84種蛋白編碼基因、30種tRNA基因和4中rRNA基因,只是不同材料間部分基因的拷貝數(shù)存在差異。共線性比較分析發(fā)現(xiàn),葉綠體基因組結(jié)構(gòu)高度保守,基本沒有發(fā)現(xiàn)序列片段的重組;并且根據(jù)四種材料葉綠體基因組上的變異位點(diǎn)（SNP與InDel）分析,顯示大多數(shù)的單堿基變異和所有的插入缺失都發(fā)生在基因組Poly結(jié)構(gòu)區(qū)域。

5.通過兩套玉米同核異質(zhì)系C48-2、48-2,C黃早四、黃早四線粒體與葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)信息、重復(fù)序列、編碼基因以及變異位點(diǎn)的比較,可以看出不育胞質(zhì)線粒體基因組較可育胞質(zhì)更復(fù)雜,主要原因可能是其存在大量的重復(fù)序列,而葉綠體基因組則高度保守。而玉米同質(zhì)異核系C48-2、C黃早四、C698-3、C478線粒體和葉綠體基因組比較分析顯示不同細(xì)胞核背景對(duì)同一細(xì)胞質(zhì)中線粒體和葉綠體基因組影響較小,主要發(fā)生在重復(fù)序列和基因間隔區(qū)存在一些差異,而編碼基因的堿基序列基本沒有差異。

參考文獻(xiàn)

[1]Male Sterility and Fertility Restoration in Crops[J].Letian Chen,Yao-Guang Liu.Annual Review of Plant Biology.2014

[2]Identification of mitochondrial DNA sequence variation and development of single nucleotide polymorphic markers for CMS-D8 in cotton[J].Hideaki Suzuki,Jiwen Yu,Fei Wang,Jinfa Zhang.Theoretical and Applied Genetics.2013(6)

[3]Rapid Evolution of Enormous,Multichromosomal Genomes in Flowering Plant Mitochondria with Exceptionally High Mutation Rates[J].Daniel B.Sloan,Andrew J.Alverson,John P.Chuckalovcak,Martin Wu,David E.McCauley,Jeffrey D.Palmer,Douglas R.Taylor.PLOS Biology.2012(1)

[4]Recombination and the maintenance of plant organelle genome stability[J].AlexandreMaréchal,NormandBrisson.New Phytologist.2010(2)

[5]邱濤.玉米同核異質(zhì)及同質(zhì)異核雄性不育系線粒體基因組比較分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.