背景[1-3]
小鼠肝細胞是從對人TGFα進行轉基因的小鼠（CD1株，MT42系）的肝細胞中建立的貼壁上皮樣細胞。
通過電子顯微鏡，這些細胞表現出典型的肝細胞特征，例如過氧化物酶體和膽小管樣結構。AML12細胞保留表達血清（白蛋白，α1抗胰蛋白酶和轉鐵蛋白）和間隙連接（連接蛋白26和32）蛋白的高水平mRNA的能力，并且僅包含乳酸脫氫酶的同工酶5。細胞表達高水平的人TGFα和較低水平的小鼠TGFα。肝特異性蛋白的表達隨培養(yǎng)時間的延長而降低，但會通過在無血清培養(yǎng)基中生長細胞而重新激活。
小鼠正常肝細胞系作為一個生物醫(yī)學領域常用的細胞實驗模型，經常為廣大科研工作者所接觸。細胞的培養(yǎng)在實驗中起到根基作用，如何爭取的培養(yǎng)與使用，則是應用實操的關鍵。
肝細胞為多角形，直徑約為20-30/加（微米），有6-8個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細胞體積變大。
每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面三種。肝細胞里面含許許多多復雜的細微結構：如細胞核、細胞質、線粒體、內質網、溶酶體、高爾基體、微粒體及飲液泡等組成。
小鼠肝細胞
小鼠肝細胞制備步驟：
1.斷頭處死成年小鼠，充分放血后迅速無菌取出肝臟組織，置于緩沖液中；
2.首先將肝組織剪成5mm邊長的組織塊，使用緩沖液洗滌2-3遍，然后進一步將肝組織剪碎成1mm3的組織小塊，使用緩沖液沖洗直至上清澄清；
3.組織塊轉移至50ml離心管內，加入10ml消化液，37%，靜置消化1h，間隔15min搖動1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反復吹打消化產物30次，消化物分別過80目、200目細胞篩，收集濾液；
5.1000rpm，室溫離心8min，收集細胞，使用基礎培養(yǎng)基重懸細胞；
6.600rpm，離心5min，重復離心純化2次，細胞經臺盼藍染色，計數，按1x106/25cm2的細胞數分瓶，使用完全培養(yǎng)基+20%FBS進行培養(yǎng)。
7.18h后換液，以后每天換液。
應用[4][5]
用于載鉛超細炭黑對CAT、SOD及小鼠肝細胞毒性效應與機理的研究
選取小鼠原代肝細胞為靶細胞,選取CAT和SOD為靶蛋白,選取UFCB作為UFPs的生物替代模型,在細胞水平和分子水平研究比對了UFCB和載鉛UFCB誘發(fā)機體氧化應激的效應與機理。
主要包括以下幾部分內容:（1）綜述了大氣顆粒物、UFPs、UFCB和鉛的污染現狀及現階段毒理學研究進展,明確了現階段對載鉛UFPs毒性機理評價的不足,確定了本次的研究目的和研究內容。
（2）利用多種方法對UFCB進行改性修飾,改性后超細炭黑（MCB）水溶液的Zeta電位為-39.7 mV,遠高于改性之前的-18.2 mV,證明MCB的分散穩(wěn)定性優(yōu)于改性之前。將MCB應用于鉛的吸附實驗,最后得到鉛含量為0.235 g/g的載鉛MCB（即Pb-MCB）。
（3）研究比對了MCB和Pb-MCB誘發(fā)小鼠肝細胞氧化應激效應的影響。實驗結果表明:肝細胞活力與MCB和Pb-MCB暴露濃度之間均呈負活力-劑量關系。細胞內MDA含量隨MCB和Pb-MCB暴露濃度的增加而升高,且在50 mg/L時達到最高,分別為對照組的204.44%和172.49%,高濃度的MDA打破了細胞內部的氧化還原平衡并破壞了細胞膜的完整性,使細胞發(fā)生脂質過氧化作用從而導致細胞活力降低甚至死亡。隨著MCB和Pb-MCB暴露濃度的升高,細胞內CAT的相對活力均呈先上升后下降的趨勢。MCB的暴露同樣導致了胞內SOD的相對活性先上升后下降,但是隨Pb-MCB暴露濃度的增加,SOD的相對活性逐步上升。比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對小鼠肝細胞氧化應激指標的影響發(fā)現,MCB的細胞毒性較Pb-MCB的細胞毒性強,原因是MCB較Pb-MCB帶更多的負電荷,更易與膜蛋白、CAT和SOD結合作用,影響細胞和酶的活力及功能表達。
（4）利用多種光譜學手段研究比對了MCB和Pb-MCB的暴露對CAT和SOD分子結構和功能的影響。結果發(fā)現:無論是MCB還是Pb-MCB都會與CAT和SOD結合,在炭黑顆粒表面形成一層“蛋白冠”類的物質,改變了CAT和SOD發(fā)色團的微環(huán)境,使蛋白質骨架結構緊縮,疏水性增強。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持續(xù)下降。CAT和SOD活性的變化一方面說明了結構的改變影響了酶的功能表達;另一方面酶與MCB或Pb-MCB的結合會影響其活性位點附近氨基酸的微環(huán)境,從而間接對酶的活性產生影響或者抑制作用。
比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對CAT和SOD分子的影響時發(fā)現,MCB對CAT和SOD結構和功能的影響大于Pb-MCB對兩種酶蛋白的影響,原因是MCB帶大量的負電荷,更易與帶正電荷的CAT或者SOD結合作用,改變酶蛋白的結構使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促進了Pb-MCB粒子的團聚沉降,粒徑的增大使Pb-MCB與酶蛋白之間的作用力和結合面積減小,因此MCB較Pb-MCB表現出更強的分子毒性。
參考文獻
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[5]賈晨號.載鉛超細炭黑對CAT、SOD及小鼠肝細胞毒性效應與機理的研究[D].山東大學,2019.