背景[1-3]
牛葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)的含量。
實驗原理:牛葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)ELISA試劑盒是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被牛葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的牛葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
牛葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)ELISA試劑盒
標(biāo)本要求
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
操作流程
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
8. 數(shù)據(jù)計算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。
應(yīng)用[4][5]
用于擬南芥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD5）基因的克隆及功能研究
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH,EC1.1.1.49），是磷酸戊糖途徑個酶，也是這一途徑的限速酶，它所催化的反應(yīng)是生物細胞中NADPH的主要來源之一。G6PDH廣泛分布于各類細胞中，是一種具有重要調(diào)控作用的胞內(nèi)酶。G6PDH不僅對生物生長有著重要作用，它所提供的NADPH參與了細胞內(nèi)的很多反應(yīng)或循環(huán)，為這些反應(yīng)提供還原力，同時G6PDH在植物的抗氧化機制中也扮演著極其重要的角色。
實驗從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中克隆出G6PD5基因，通過構(gòu)建克隆載體對其序列進行了檢測和比對；為了驗證G6PDH的功能，本實驗構(gòu)建了植物表達載體并對擬南芥進行侵染，成功培育出G6PD5超表達體系擬南芥。通過對比野生型擬南芥（At）、G6PD5超表達體系擬南芥（G6PD5）和G6PDH被抑制的擬南芥（g6pd5）的生長狀況和生理指標(biāo)，驗證了G6PD5的對植物生長的重要作用。
結(jié)果表明，G6PD5組擬南芥在長勢上略優(yōu)于At組，而g6pd5組的擬南芥明顯弱于其他兩組。對其常態(tài)酶活的測定結(jié)果顯示At組擬南芥G6PDH酶活達到27.5U/mg，G6PD5組的酶活達到52U/mg，提高了89.1%；而g6pd5組擬南芥的酶活則為17.5U/mg，降低了36.4%。
實驗還將各組擬南芥進行了不同程度的氧脅迫處理，通過對不同處理條件下的不同組擬南芥幼苗中與氧化脅迫有關(guān)的小分子物質(zhì)（O2-，GSH）以及相關(guān)酶（GR）的測定，對三組擬南芥的抗氧化脅迫能力進行對比。在NaCl處理下的個組擬南芥，其中G6PD5組的酶活下降幅度最小，由92.5U/mg降低到72.9U/mg，降低了21%，其他兩組的G6PDH活性分別降低了55.6%、59.7%；NaHCO3處理下G6PD5組的酶活降低了70.5%，其他兩組的G6PDH活性分別降低了88.9%、89.5%；H2O2處理中G6PD5組的酶活降低了23.2%，其他兩組的G6PDH活性分別降低了33%、62.8%。
本實驗分別選取100mmol/L NaCl、30mmol/L NaHCO3、40mmol/L H2O2處理后的擬南芥幼苗，對其O2-的含量、GSH含量、GR活性進行測定。實驗結(jié)果顯示，G6PD5組的擬南芥O2-增加量較小，分別增加了74%，90%，212%，At組分別增加了169%，149%，325%，g6pd5組分別增加了261%、226%、375%；G6PD5組擬南芥GSH含量分別增加了32%，38.3%，46.8%，At組分別增加了30.1%，21.3%，41.8%，g6pd5組分別增加了22.3%、-6.1%、10.6%；G6PD5組的擬南芥GR活性分別增加了75.4%，86%，23.8%，At組分別增加了55.8%，78.7%，18.3%，g6pd5組分別增加了-22.2%、-12.7%、7.9%。
G6PD5超表達體系擬南芥中無論是G6PDH還是GR得活性都會比其他兩組擬南芥更穩(wěn)定，這一組擬南芥可以在較大范圍的脅迫程度中保持其酶活的相對穩(wěn)定，且能夠有效的清除對其自身有害的O2-，使O2-能夠保持在較低的水平。
參考文獻
[1]Reductive whole-cell biotransformation with Corynebacterium glutamicum:improvement of NADPH generation from glucose by a cyclized pentose phosphate pathway using pfkA and gapA deletion mutants[J].Solvej Siedler,Steffen N.Lindner,Stephanie Bringer,Volker F.Wendisch,Michael Bott.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(1)
[2]Oxidative stress and condition-dependent sexual signals:more than just seeing red[J].Michael Garratt,Robert C.Brooks.Proceedings of the Royal Society B.2012(1741)
[3]Glucose‐6‐phosphate dehydrogenase,NADPH,and cell survival[J].Robert C.Stanton.IUBMB Life.2012(5)
[4]Strategies for Reducing or Preventing the Generation of Oxidative Stress[J].B.Poljsak,Antonio Ayala.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2011
[5]王旭.擬南芥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD5）基因的克隆及功能研究[D].黑龍江大學(xué),2013.