背景[1-3]
人甲狀腺過氧化物酶(TPO)ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人甲狀腺過氧化物酶（TPO）的含量。
檢測原理:試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人甲狀腺過氧化物酶（TPO）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人甲狀腺過氧化物酶（TPO）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人甲狀腺過氧化物酶(TPO)ELISA試劑盒
樣品收集、處理及保存方法
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
操作步驟
1.從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4.隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
應(yīng)用[4][5]
用于定量檢測人甲狀腺過氧化物酶抗體的熒光酶免疫法的建立及臨床應(yīng)用研究
利用分子生物學(xué)方法在原核系統(tǒng)表達(dá)hTPO抗原決定簇片段,以基因工程產(chǎn)品為抗原,建立定量檢測hTPOAb的FEIA,并用于臨床作為AITD的診斷、鑒別診斷和療效監(jiān)測手段。
方法：在表達(dá)菌株E.Coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)含有本室構(gòu)建的hTPO抗原決定簇“熱點”區(qū)基因（1702-2622,編號相對于起始密碼,編碼AA568-874）的重組表達(dá)質(zhì)粒pGESJ,經(jīng)純化獲得GST-hTPO（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-人甲狀腺過氧化物酶）融合蛋白,并對其進(jìn)行分子量和免疫活性鑒定。以重組融合蛋白GST-hTPO為抗原包被96孔透明板,樣品血清中hTPOAb為一抗,堿磷酶標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗,4-MUP（4-甲基磷酸傘形酮）為熒光底物建立了板式FEIA,利用經(jīng)國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品校正的本室標(biāo)準(zhǔn)物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以實現(xiàn)本法的定量檢測,并對本法的特異性、精密度、準(zhǔn)確度、健全性等進(jìn)行了方法學(xué)鑒定。
用該法測定262例正常人,五類甲狀腺疾病患者534例,包括Graves’病（GD）270例,橋本氏?。℉T）166例,單純甲腫43例,亞甲炎38例,腺瘤17例。
結(jié)果：1.GST-TPO融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定以E.Coli BL21為表達(dá)菌株,以IPTG（isopropylβ-D-thoiglactoside,異丙基β-D-硫代半乳糖苷）為誘導(dǎo)劑,濃度0.1mM,25℃誘導(dǎo)5.5小時,產(chǎn)物經(jīng)Glutathione Sepharose 4B（谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B）親和層析純化后,使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳）測定GST-hTPO分子量結(jié)果為61.24KD,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色法定量獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)率為12mg/L培養(yǎng)基,FEIA結(jié)果證明GST-hTPO具有良好免疫活性。將包被GST-hTPO并封閉的透明板條凍存于-80℃冰箱,以ELISA進(jìn)行6個月的觀察,得到陰性、陽性批間變異系數(shù)分別為12.30%和6.78%。
2. 以融合蛋白為抗原建立定量熒光發(fā)光酶免疫分析技術(shù)并進(jìn)行方法學(xué)鑒定反應(yīng)條件的優(yōu)化：按交叉連續(xù)稀釋法組合包被抗原量,人血清稀釋倍數(shù),二抗稀釋倍數(shù),結(jié)果在不同條件組合中當(dāng)包被抗原量為1μg/孔,人血清稀釋倍數(shù)為1：100,二抗稀釋倍數(shù)為1：20000時,37℃溫育60分鐘時陽性血清與陰性血清的差距可達(dá)到10倍,故選作條件。最后加入終止液EDTA反應(yīng)達(dá)到平衡后測量。確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線六個點的濃度分別為180 IU/ml,100 IU/ml,17 IU/ml,6 IU/ml,3 IU/ml及2IU/ml。
方法學(xué)鑒定,特異性：該融合蛋白與甲狀腺球蛋白抗體無交叉反應(yīng)；精密度：取陽性、陰性對照血清各六孔測定得到批內(nèi)變異分別為5.14%、19.36%,兩個月內(nèi)測定六次陽性、陰性對照血清得到批間變異分別為6.72%、17.90%；準(zhǔn)確度：測定高、中、低樣品回收率分別為102%、92%、100%；健全性：將一份HT患者血清分別進(jìn)行兩次對倍稀釋,以測定的三個濃度值繪制成稀釋曲線,得到的稀釋曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本平行；相關(guān)性：將本法與雅培公司AXSYM System hTPOAb試劑盒共同檢測61份血清,結(jié)果顯著相關(guān)R=0.80,P＜0.01。
3.臨床應(yīng)用經(jīng)測定262例健康人血清,得到hTPOAb陽性切線值為5IU/mL。用此方法測定病人血清hTPOAb,測定甲狀腺疾病患者h(yuǎn)TPOAb以中位數(shù)表示,HT為11.5IU/ml,陽性率89.76%；GD治療前是4IU/ml,陽性率32.35%；GD治療后是4IU/ml,陽性率31.68%；亞甲炎組為4IU/ml,陽性率26.32%：單純甲腫為3IU/ml,陽性率為0；腺瘤為4IU/ml,陽性率11.76%。HT患者血清hTPOAb陽性率與其它各組有顯著差異（p＜0.01）。
參考文獻(xiàn)
[1]Value of Combined Clinical Information and Thyroid Peroxidase Antibodies in Pregnancy for the Prediction of Postpartum Thyroid Dysfunction[J].SheilaMamede da Costa,LinoSieiro Netto,Claudia MedinaCoeli,AlexandruBuescu,MarioVaisman.American Journal of Reproductive Immunology.2007(4)
[2]Is simultaneous measurement of anti-thyroid peroxidase and anti-thyroglobulin antibodies clinically useful in patients with thyroid dysfunction?[J].Luca Giovanella.Clinical Chemical Laboratory Medicine.2007(2)
[3]EEG Changes in a Patient With Steroid-Responsive Encephalopathy Associated With Antibodies to Thyroperoxidase（SREAT,Hashimoto?s Encephalopathy）[J].Alcibiades J.Rodriguez,Gregory A.Jicha,Thomas D.L.Steeves,Eduardo E.Benarroch,Barbara F.Westmoreland.Journal of Clinical Neurophysiology.2006(4)
[4]Performance characteristics of 5 automated thyroglobulin autoantibody and thyroid peroxidase autoantibody assays[J].Sonia L.La’ulu,Patricia R.Slev,William L.Roberts.Clinica Chimica Acta.2006(1)
[5]張艷麗.定量檢測人甲狀腺過氧化物酶抗體的熒光酶免疫法的建立及臨床應(yīng)用[D].天津醫(yī)科大學(xué),2008.