背景[1-3]
人性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)ELISA試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中SHBG濃度。
檢測原理:本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人SHBG抗體包被于酶標板上，實驗時樣品（或標準品）中的人SHBG會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗人SHBG抗體，HRP-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份TMB底物液。TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，SHBG濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中SHBG的濃度。
人性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)ELISA試劑盒
樣品收集:
1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。
操作步驟：
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的指標標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
應(yīng)用[4][5]
用于性激素、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、及其聯(lián)合效應(yīng)對2型糖尿病風險的預(yù)測作用研究
探索性激素、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、及其聯(lián)合效應(yīng)對2型糖尿病風險的預(yù)測作用。
研究方法:在環(huán)境、炎癥和代謝性疾病研究（EIMDS）（2008-13）中開展前瞻性巢式病例對照研究。基線時共納入3510例未患糖尿病的受試者,隨訪5年后共有145例男性和87例絕經(jīng)后女性進展為2型糖尿病。
隨機選擇年齡、性別匹配的糖耐量正常受試者作為對照組。將基線SHBG、雌二醇、睪酮、脫氫表雄酮的濃度劃分為三分位,受試者與之對應(yīng)劃分為低、中和高暴露水平。利用相關(guān)性分析觀察性激素血空腹血糖、OGTT 2小時血糖的相關(guān)性;利用多元回歸模型計算性激素、SHBG以及性激素和SHBG的聯(lián)合效應(yīng)對2型糖尿病的預(yù)測作用。研究結(jié)果:在男性和女性,基線SHBG水平與空腹血糖變化值、OGTT 2小時血糖變化值均顯著負相關(guān);在男性,基線雌二醇水平與空腹血糖變化值、OGTT 2小時血糖變化值均顯著正相關(guān);基線睪酮水平與空腹血糖變化值、OGTT 2小時血糖變化值均顯著負相關(guān);在女性,基線SHBG水平與空腹血糖變化值、OGTT 2小時血糖變化值均顯著負相關(guān)。
多元回歸模型校正年齡、性別、BMI等混雜因素后,基線低SHBG水平的男性比高SHBG水平的男性患2型糖尿病的風險增加4倍;高雌二醇水平的男性比低雌二醇水平的男性患2型糖尿病的風險增加四倍。
聯(lián)合效應(yīng)分析顯示低SHBG+高雌二醇水平的男性比高SHBG+低雌二醇水平的男性患2型糖尿病的風險增加20倍[OR20.23;95%可信區(qū)間（CI）4.62-51.33]。在男性受試者中,睪酮、脫氫表雄酮不能獨立預(yù)測2型糖尿病的發(fā)生;睪酮或脫氫表雄酮聯(lián)合SHBG與2型糖尿病的發(fā)生風險亦無相關(guān)性。在女性受試者中,隨著SHBG水平增高,患2型糖尿病的風險顯著降低[OR 0.92（95%CI 0.21-4.53）,0.14（95%CI 0.10-0.74）;P=0.043];雌二醇、睪酮和脫氫表雄酮單獨或聯(lián)合SHBG均與2型糖尿病的發(fā)病風險無關(guān)。
結(jié)論:男性和女性體內(nèi)的SHBG是2型糖尿病的獨立保護因素;男性雌二醇是2型糖尿病的獨立危險因素;低SHBG與高雌二醇的聯(lián)合作用可以預(yù)測男性2型糖尿病的發(fā)生。
參考文獻
[1]Sex Steroid Actions in Male Bone[J].Dirk Vanderschueren,Micha?l R.Laurent,Frank Claessens,Evelien Gielen,Marie K.Lagerquist,Liesbeth Vandenput,Anna E.B?rjesson,Claes Ohlsson.Endocrine Reviews.2014(6)
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[3]Effect of Testosterone Treatment on Glucose Metabolism in Men With Type 2 Diabetes:A Randomized Controlled Trial[J].Gianatti,Emily J,Dupuis,Philippe,Hoermann,Rudolf,Strauss,Boyd J,Wentworth,John M,Zajac,Jeffrey D,Grossmann,Mathis.Diabetes Care.2014(8)
[4]Fasting Serum Lipid and Dehydroepiandrosterone Sulfate as Important Metabolites for Detecting Isolated Postchallenge Diabetes:Serum Metabolomics via Ultra-High-Performance LC-MS[J].Liu,Liyan,Wang,Maoqing,Yang,Xue,Bi,Mingxin,Na,Lixin,Niu,Yucun,Li,Ying,Sun,Changhao.Clinical Chemistry.2013(9)
[5]張皚頻.性激素、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、及其聯(lián)合效應(yīng)對2型糖尿病風險的預(yù)測作用[D].重慶醫(yī)科大學,2017.