背景^[1-3]

腺苷酸激酶抗體是一類可以特異性結(jié)合腺苷酸激酶的多克隆抗體，主要用于體外檢測(cè)腺苷酸激酶的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。

腺苷酸激酶adenylate kinase催化腺苷三磷酸（ATP）使腺苷酸（AMP）磷酸化而生成腺苷二磷酸（ADP）反應(yīng)的酶，EC 2．7．4．3．逆反應(yīng)由2個(gè)分子ADP生成ATP和AMP。

最初為科洛韋克和卡爾查爾（S．P．Colowick andH．M．Kalckar，1943）在肌肉中發(fā)現(xiàn)，稱為肌激酶。已知在肝臟、腎臟、微生物中都存在。脫氧腺苷酸也可以作為底物。此酶特別穩(wěn)定，即使在0.1NHCl中加熱到100℃，或用三氯乙酸處理，也不易失去活性。但可由氧化劑或SH試劑或胰蛋白酶的作用而失活。需要有Mg2+存在。

腺苷酸激酶抗體

肌激酶亦稱腺苷酸激酶，可逆地催化兩分子ADP產(chǎn)生一分子ATP及一分子AMP的酶。在哺乳動(dòng)物中存在三種同工酶，即AK1、AK2和AK3。腺苷酸激酶(肌激酶)（AK）家族同工酶是細(xì)胞內(nèi)核苷酸合成的機(jī)器。核苷酸既是核酸結(jié)構(gòu)的組成部分，又在細(xì)胞代謝、許多生物合成途徑以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為化學(xué)能的來(lái)源或作為活化的中間體，又或作為輔酶的成分發(fā)揮作用。由于細(xì)胞膜上沒有其相應(yīng)的載體蛋白，并且?guī)ж?fù)電荷的磷酸基團(tuán)會(huì)阻止其通過(guò)膜擴(kuò)散，所以所有核苷酸需要在細(xì)胞內(nèi)合成。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中核苷酸的合成有兩種途徑，一種稱為從頭合成途徑，另一種為補(bǔ)救途徑，這兩種途徑都涉及到許多核苷和核苷酸激酶。核苷酸合成缺陷會(huì)引起一些疾病，但現(xiàn)缺乏有效的治療方法。增加有關(guān)核苷酸的合成代謝途徑知識(shí)，對(duì)于疾病的診斷和治療非常重要。

應(yīng)用^[4][5]

腺苷酸激酶抗體用于甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及載體構(gòu)建研究

采用RACE技術(shù)從自有淀粉專用型甘薯新品種“渝蘇303”（國(guó)審薯2002006）中克隆了ADK基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)該基因及其所編碼的ADK蛋白進(jìn)行了詳盡的生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)譜分析。

獲得結(jié)果如下：根據(jù)已知腺苷酸激酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得592bp的核心片段；BLAST分析表明該片段與其它植物ADK同源，初步確定為甘薯的ADK基因核心片段；根據(jù)該序列設(shè)計(jì)用于3’-RACE和5’-RACE的基因特異性引物，擴(kuò)增獲得548bp的3’-末端和314bp的5’-末端；將核心片段、3’-末端和5’-末端序列進(jìn)行拼接，獲得甘薯ADK基因的cDNA電子全長(zhǎng)，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得其物理全長(zhǎng)。

IbADK全長(zhǎng)1314bp，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為855bp，編碼長(zhǎng)度為284個(gè)氨基酸殘基的ADK蛋白（IbADK）；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)IbADK分子量為30.86kDa，等電點(diǎn)為6.46；BLAST分析顯示IbADK與馬鈴薯ADK序列相似性達(dá)到83％；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)IbADK的N-端有一段長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，表明該蛋白定位于質(zhì)體，這與淀粉合成定位于質(zhì)體相一致；將IbADK與植物ADKs構(gòu)建分子發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯ADK蛋白與IbADK聚為一類，表明兩者在進(jìn)化上比較接近，這與BLAST結(jié)果相符；對(duì)IbADK進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明其中包含26.06％的α-螺旋、23.59％的片層和50.35％的隨機(jī)卷曲；進(jìn)一步對(duì)IbADK進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，表明該蛋白能夠正常折疊形成典型的ADK蛋白三維結(jié)構(gòu)，并在其三維結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了AMP結(jié)合位點(diǎn)和ATP-AMP（Ap5A）結(jié)合位點(diǎn)；利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)IbADK進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，表明該基因在塊根和幼葉中表達(dá)量最高，在成熟葉片和莖中表達(dá)量次之，在葉柄中則檢測(cè)不到IbADK的表達(dá)。

已有研究表明，淀粉合成定位于兩種質(zhì)體，即葉片中的葉綠體和塊根中的淀粉體。因此在甘薯塊根和幼葉中IbADK的高表達(dá)，有利于促進(jìn)這兩種代謝活躍的組織中ATP、AMP和ADP分子的代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)淀粉代謝和核苷酸代謝。對(duì)IbADK的克隆分析和性質(zhì)研究，有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解IbADK的功能，并且對(duì)于研究甘薯淀粉合成的分子機(jī)理有一定幫助。前人研究表明：適當(dāng)下調(diào)ADK表達(dá)量，可以促使腺苷酸代謝庫(kù)向淀粉合成的方向流動(dòng)。

本研究設(shè)計(jì)一對(duì)帶酶切位點(diǎn)的引物，克隆IbADK的編碼區(qū)，反向插入到植物表達(dá)載體pHB中，構(gòu)建IbADK反義表達(dá)載體pHB-aIbADK，同時(shí)構(gòu)建正義表達(dá)載體pHB-IbADK作為對(duì)照，將pHB-aIbADK和pHB-IbADK分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404和“解除武裝”的C58C1，獲得農(nóng)桿菌工程菌。構(gòu)建的反義表達(dá)工程菌不但可用于在分子遺傳學(xué)水平探討ADK在甘薯淀粉生物合成中的作用機(jī)理，而且可進(jìn)一步用于遺傳轉(zhuǎn)化甘薯，獲得低ADK表達(dá)的轉(zhuǎn)基因甘薯，為實(shí)現(xiàn)甘薯淀粉代謝工程，最終獲得轉(zhuǎn)基因修飾的高淀粉甘薯新材料或新品種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[5]曾令江.甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及載體構(gòu)建[D].西南大學(xué),2007