背景^{[1][2][3][4][5]}

MG-132 (Proteasome抑制劑)是一種有效的，可逆的，可透過細(xì)胞的蛋白酶體抑制劑（Ki=4 nM）。N-芐氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸MG132屬于合成肽醛類抑制劑。它通過26S復(fù)合物降低哺乳動物細(xì)胞和酵母可滲透菌株中泛素-共軛蛋白的降解，而不影響其ATP酶或肽酶活性。MG132激活c-Jun N-末端激酶（JNK1），其啟動細(xì)胞凋亡。

MG132還以3μM的IC 50抑制NF-κB活化，并阻斷β-分泌酶活性。在具有約50μMMG132的IC 50的HeLa細(xì)胞中觀察到劑量依賴性的細(xì)胞生長抑制24小時。MG132通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯以及引發(fā)細(xì)胞凋亡來抑制HeLa細(xì)胞的生長。MG-132以時間和劑量依賴性方式抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖（24小時時IC 50值為18.5μM）。MG-132（18.5μM）在3小時時抑制蛋白酶體活性約70％。

MG-132通過下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2和XIAP，促凋亡蛋白Bax和半胱天冬酶-3的上調(diào)以及切割的C端85kDa PARP的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MG-132還會使活性氧增加5倍以上。IC 50MG-132對孵育48小時后對HeLa，CaSki和C33A宮頸癌細(xì)胞存活率的影響分別為2.1,3.2和5.2μM。使用sc異種移植模型檢查MG-132對宮頸癌的體內(nèi)抗腫瘤活性。

使用以下方案以1mg/kg注射MG-132：對于攜帶HeLa腫瘤的小鼠，第1,4,8,12,15,18,23和26天。與對照相比，MG132的生長抑制率為49％。MG-132（ip，0.1 mg/kg/day）通過調(diào)節(jié)ERK1/2和JNK1信號通路，減輕壓力超負(fù)荷引起的心臟肥大，改善腹主動脈條帶（AAB）大鼠的心臟功能。

研究應(yīng)用^[6]

MG-132 (Proteasome抑制劑)可用于誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和自噬的機(jī)制研究。研究方法蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitors,PIs）可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的周期,阻止其無限增殖,PIs尤其可以選擇惡性程度高的腫瘤細(xì)胞首先發(fā)揮毒性作用。因此,選擇PIs治療HCC是有希望的。MG132是PIs中的一種,更是一種天然的PIs。并且,已經(jīng)證明MG132能夠?qū)CC細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。

MG132對HCC細(xì)胞的毒性作用涉及多種途徑,如p53、MAPK和AKT,以及多種基因如TRAIL等。但是MG132在治療HCC細(xì)胞中的更加全面的調(diào)控機(jī)制并不是很清楚。為了MG132能夠更早更好的應(yīng)用臨床治療HCC,對MG132治療HCC的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更加深入全面的探討是有必要的。SIRT2是一種去乙?；?與一些E3泛素連接酶具有相互作用。

SIRT2參與細(xì)胞的有絲分裂,通過細(xì)胞周期影響細(xì)胞的增殖。并且,SIRT2在HCC組織和細(xì)胞中高表達(dá),與HCC的惡性程度呈正相關(guān)。有證據(jù)證明,慢病毒介導(dǎo)的SIRT2沉默能夠抑制HCC細(xì)胞的增殖,說明SIRT2的下調(diào)將有助于HCC的治療。但是,在使用MG132治療HCC的過程中是否能夠引起SIRT2下調(diào),并沒有研究。因此,為了全面地了解MG132在治療HCC過程中的功能,在HCC細(xì)胞中展開對MG132和SIRT2的研究是有必要的。

目的本研究通過初步探討MG132在抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡和自噬的調(diào)控機(jī)制,旨在闡明SIRT2在MG132處理SMMC-7721細(xì)胞過程中的作用。并且通過對MG132抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖過程中機(jī)制的研究,為MG132治療HCC提供更多的理論依據(jù),最終將有助于治療HCC新藥物的開發(fā)。

方法：
1.選取HCC細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞做為研究對象,用MTT檢測2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM濃度的MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h的細(xì)胞活力。
2.用20μM的MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h,用hoechst33258染色檢測是否有凋亡小體;western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的變化;用MDC染色檢測自噬小體;western blot檢測自噬蛋白LC3I和LC3II的變化。
3.選取20μM MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞6 h、12 h和24 h,用western blot檢測SIRT2、LC3I、LC3II、ATG7、STAT3和P-STAT3的變化。
4.SIRT2轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞。
5.20μM MG132培養(yǎng)正常、轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞株6 h、12 h、18 h和24 h,用MTT檢測細(xì)胞的抑制率。
6.20μM MG132培養(yǎng)轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞株24 h,用western blot檢測LC3I和LC3II的變化;用MDC染色比較兩種細(xì)胞自噬程度的差異;用細(xì)胞凋亡流式和hoechst33258染色比較兩種細(xì)胞凋亡程度的差異。

結(jié)果：
1.MTT結(jié)果表明,隨著MG132濃度和時間的增加SMMC-7721細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。
2.MDC和hoechst33258染色以及western blot結(jié)果看出,使用20μM MG132處理SMMC-7721細(xì)胞24 h,與對照組相比MG132處理組細(xì)胞出現(xiàn)了的凋亡和自噬特征。
3.選擇20μM MG132培養(yǎng)正常SMMC-7721細(xì)胞6 h、12 h和24 h,SIRT2的蛋白表達(dá)水平在12 h和24 h出現(xiàn)了明顯的下調(diào);同時自噬相關(guān)蛋白ATG7表達(dá)上調(diào)和標(biāo)志性蛋白LC3II表達(dá)上調(diào);同時檢測到P-STAT3下調(diào)。
4.選擇20μM MG132培養(yǎng)細(xì)胞24 h,MTT檢測到正常細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株的抑制率高于轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株。
5.選擇20μM MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h后,western blot、MDC染色、細(xì)胞凋亡流式和hoechst33258染色的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株和自噬特征比轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株凋亡現(xiàn)象更加顯著。

結(jié)論:
1.MG132能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡和自噬。
2.MG132通過下調(diào)SIRT2抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和自噬。

參考文獻(xiàn)

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