背景[1-3]
人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞是從小腸腸系膜轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞中建立的。據(jù)報道，它含有完整的HPV-16(每個細(xì)胞大約600個拷貝)和HPV-18相關(guān)序列。
人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞
人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)步驟:
一．人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）RPMI-1640+10%FBS+1%P/S
2）人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)條件：Atmosphere:Air,95%;CO2,5%，Temperature:37℃。
3）人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
4）Gene Expression：beta subunit of human chorionic gonadotropin(hCG);tumor associated antigen
二．人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1．人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識。明舟生物（mingzhoubio）按每個凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個細(xì)胞凍存。
3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞可以用于毛鉤藤堿對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響
探討毛鉤藤堿對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲的影響及機制。
方法:細(xì)胞活性與增殖檢測(CCK-8)法檢測細(xì)胞增殖活性,Hoechst 33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax),p53 mRNA表達(dá),劃痕實驗檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測纖連蛋白(FN),基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)含量,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)。
結(jié)果:與空白組比較,毛鉤藤堿可以呈劑量及時間依賴性的抑制Ca Ski細(xì)胞的增殖;8.0,16.0,32.0μmol·L-1毛鉤藤堿組細(xì)胞凋亡率,Bax,p53 mRNA表達(dá)增加(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 mRNA及磷酸化Src(p-Src),磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)蛋白表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01)。與空白組比較,1.0,2.0,4.0μmol·L-1毛鉤藤堿組細(xì)胞遷移率,穿膜細(xì)胞數(shù),FN,MMP-2,MMP-9含量及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α),波形蛋白(Vimentin),N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01),E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)增加(P<0.01)。
結(jié)論:毛鉤藤堿可以抑制人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲,并能誘導(dǎo)凋亡,作用機制與調(diào)控Src/STAT3及HIF-1α/上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)信號通路有關(guān)。
參考文獻(xiàn)
[1]Long non-coding RNA PTAR inhibits apoptosis but promotes proliferation,invasion and migration of cervical cancer cells by binding miR-101.[J].Wang Xuehe;Sun Huaqin;Zhu Simin.Bioengineered,2021(1)
[2]Trichosanthin inhibits cervical cancer by regulating oxidative stress-induced apoptosis.[J].Zhu Chenglu;Zhang Cuilan;Cui Xiaoming;Wu Jing;Cui Zhizhu;Shen Xiaojuan.Bioengineered,2021(1)
[3]The Outcome of Locally Advanced Cervical Cancer in Patients Treated with Neoadjuvant Chemotherapy Followed by Radical Hysterectomy and Primary Surgery.[J].Mousavi Azamsadat;Modarres Gilani Mitra;Akhavan Setareh;Sheikh Hasani Shahrzad;Alipour Abbas;Gholami Hamideh.Iranian journal of medical sciences,2021(5)
[4]The role of lymph nodes in cervical cancer:incidence and identification of lymph node metastases-a literature review.[J].Olthof Ester P;van der Aa Maaike A;Adam Judit A;Stalpers Lukas J A;Wenzel Hans H B;van der Velden Jacobus;Mom Constantijne H.International journal of clinical oncology,2021(9)
[5]李亞威,謝磊,王娜.毛鉤藤堿對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2022,28(04):109-115.