背景^[1-3]

人骨髓瘤細(xì)胞是由骨髓瘤患者的惡性積液建立的。是一株人骨髓瘤細(xì)胞，主要用于人骨髓瘤疾病研究等。

人骨髓瘤細(xì)胞

人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞特性:

1)來源：人骨髓

2)形態(tài)：淋巴母細(xì)胞樣，懸浮生長

3)含量：>lxl06個(gè)/mL

4)污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性。

人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞接受后的處理：

1.收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液。

2.請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37°C培養(yǎng)約2-3h。

3.棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml完全培養(yǎng)基。

4.如果細(xì)胞長滿（90%以上）請及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)用6ml完全培養(yǎng)基。

5.接到細(xì)胞次日，請檢查細(xì)胞是否污染。

人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程

1)人骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

準(zhǔn)備RPIVM-1640培養(yǎng)基，90%;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%;50 y M 2-巰基乙醇。

人骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%;二氧化碳，5%。溫度：37°C，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

人骨髓瘤細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2)人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞處理：

復(fù)蘇人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞：將含有l(wèi)mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37°C水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入lmL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加l-2mL培養(yǎng)液后吹句，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

人骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走)，加入部分新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進(jìn)行凍存。

應(yīng)用^[4][5]

人骨髓瘤細(xì)胞可以用于冬凌草甲素體外誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞H929和MM.1S凋亡與Akt信號通路

冬凌草甲素誘導(dǎo)H929和MM.1S細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究目的:探討ORI對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞H929和MM.1S增殖和凋亡的影響,及可能的作用機(jī)制。

方法:1.0、1、2、4、8、16、32μM ORI分別處理H929和MM.1S細(xì)胞12、24和36 h,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖抑制率。2.0、8、12、16μM ORI處理H929細(xì)胞24h和0、2、4、8μM ORI處理MM.1S細(xì)胞24h,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;TUNEL+DAPI法檢測細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率。3.蛋白印跡技術(shù)(Western blot,WB)檢測一定濃度ORI處理前后Bax、BCL-2、caspase-3、PARP以及PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt的表達(dá)變化。

結(jié)果:1.1、2、4、8、16、32μM ORI體外能有效抑制多發(fā)性骨髓瘤H929和MM.1S細(xì)胞增殖,與濃度、時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.05);在H929細(xì)胞,12h、24h、36h的IC50值分別為21.32±0.45μM,14.05±0.71μM,11.37±0.87μM;在MM.1S細(xì)胞,12h、24h、36h的IC50值分別為9.18±0.22μM,6.05±0.36μM,4.37±±0.87μM;ORI(1、2、4、8μM)對MM.1S細(xì)胞的增殖抑制率較H929細(xì)胞更為顯著(P<0.05)。

2. 與對照組比較,在光學(xué)顯微鏡下觀察到H929和MM.1S細(xì)胞明顯的核固縮、核碎裂征象;TUNEL+DAPI染色后熒光顯微鏡下可見H929和MM.1S細(xì)胞核固縮、凋亡小體等細(xì)胞凋亡特征。

3. AnnexinV-FITC聯(lián)合PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),H929和MM.1S細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性遞增,H929細(xì)胞24h細(xì)胞凋亡率分別為(1.17±0.46)%,(7.30±1.28)%,(23.30±2.1 3)%,(57.20±2.60)%(P<0.05);MM.1S細(xì)胞24h細(xì)胞凋亡率分別為(1.48±0.3 9)%,(2.06±0.55)%,(8.25±1.43)%,(37.13±3.60)%(P<0.05)。

4. WB結(jié)果提示,隨著ORI濃度的增加,兩株細(xì)胞pro-caspase-3、BCL-2、p-PI3K、p-Akt表達(dá)呈濃度依賴性遞減,而Bax、Cleaved PARP表達(dá)遞增,說明細(xì)胞發(fā)生凋亡。

結(jié)論:一定濃度ORI在體外能有效抑制骨髓瘤細(xì)胞株H929和MM.1S細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;其可能的分子機(jī)制與下調(diào)PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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