背景^[1-3]

CCD-1095Sk細(xì)胞是從左乳房的活體組織切片的正常皮膚建立。病人患有乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌并患有乳頭濕疹樣癌本病。這一代次的細(xì)胞已經(jīng)過兩次數(shù)目倍增，約可再進(jìn)行10次數(shù)目倍增。

CCD-1095Sk細(xì)胞

CCD-1095Sk細(xì)胞培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇CCD-1095Sk細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）CCD-1095Sk細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）CCD-1095Sk細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；

1.CCD-1095Sk細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

CCD-1095Sk細(xì)胞可以用于MiRNA-362-5p對(duì)乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響

多種的microRNA參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變過程，如惡性增殖，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，凋亡抑制等。有研究報(bào)道，利用microRNA抑制劑降低乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA-21后，抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及腫瘤的生長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)為乳腺癌的基因治療提供的一個(gè)新的方向。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討一個(gè)新的miRNA-362-5p乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響，以及相關(guān)的作用機(jī)制。

在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中首先檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MB231與正常細(xì)胞CCD-1095SK中miRNA-362-5p的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miRNA-362-5p在乳腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。為了探討miRNA-362-5p的高表達(dá)是否影響乳腺癌的生物學(xué)行為，將miRNA-362-5p的抑制劑轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，當(dāng)MCF-7細(xì)胞中miRNA-362-5p的表達(dá)被抑制后，細(xì)胞的增殖能力受到了明顯抑制。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這是由于轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞被限制在G0期向S期轉(zhuǎn)化的進(jìn)程中，而G2/M期未受明顯影響。

隨后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力受到了明顯的抑制。Transwell方法檢測(cè)侵襲能力同樣表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力被抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-362-5p對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響，我們運(yùn)用平板克隆實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的克隆形成能力明顯下降，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的粘附能力亦受到抑制。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)指出，miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡亦有影響，因此利用順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡能力的影響，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明miRNA-362-5p的高表達(dá)有可能促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制了其凋亡的發(fā)生。

在實(shí)驗(yàn)室前期的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，在白血病細(xì)胞中miRNA-362-5p通過靶向CYLD促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活從而促進(jìn)了白血病細(xì)胞的增殖和侵襲，為了驗(yàn)證在乳腺癌細(xì)胞中miRNA-362-5p是否同樣是通過這一途徑來發(fā)揮作用的，將miRNA-362-5p的抑制劑及模擬物分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞及CCD-1095SK細(xì)胞，westernblot檢測(cè)CYLD的表達(dá)情況及NF-κB信號(hào)通路的活化情況，結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中當(dāng)miRNA-362-5p被抑制后，CYLD的表達(dá)得到了恢復(fù)而入核的NF-κB則下調(diào)，在CCD-1095SK細(xì)胞中當(dāng)miRNA-362-5p的表達(dá)恢復(fù)以后，CYLD的表達(dá)下調(diào)而入核的NF-κB則上調(diào)，由此說明在乳腺癌細(xì)胞中，miRNA-362-5p抑制了CYLD的表達(dá)從而促進(jìn)了NF-κB信號(hào)通路的激活。

總而言之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA-362-5p在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制了細(xì)胞的凋亡，這一作用可能與其抑制了CYLD的表達(dá)從而促進(jìn)了NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Implication of microRNAs in drug resistance for designing novel cancer therapy[J].Fazlul H.Sarkar;;Yiwei Li;;Zhiwei Wang;;Dejuan Kong;;Shadan Ali.Drug Resistance Updates,2010(3)

[2]Function of miR-146a in Controlling Treg Cell-Mediated Regulation of Th1 Responses[J].Li-Fan Lu;;Mark P.Boldin;;Ashutosh Chaudhry;;Ling-Li Lin;;Konstantin D.Taganov;;Toshikatsu Hanada;;Akihiko Yoshimura;;David Baltimore;;Alexander Y.Rudensky.Cell,2010(6)

[3]Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancer:Parallels Between Normal Development and Tumor Progression[J].Douglas S.Micalizzi;;Susan M.Farabaugh;;Heide L.Ford.Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,2010(2)

[4]Downregulation of miRNA-200c Links Breast Cancer Stem Cells with Normal Stem Cells[J].Yohei Shimono;;Maider Zabala;;Robert W.Cho;;Neethan Lobo;;Piero Dalerba;;Dalong Qian;;Maximilian Diehn;;Huiping Liu;;Sarita P.Panula;;Eric Chiao;;Frederick M.Dirbas;;George Somlo;;Renee A.Reijo Pera;;Kaiqin Lao;;Michael F.Clarke.Cell,2009(3)

[5]桂照華.MiRNA-362-5p對(duì)乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2013.