背景^[1-3]

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞分離自一位72歲男性直腸原位癌，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，是常用的腸癌細(xì)胞模型。

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞分離自直腸原位癌；當(dāng)長到滿時，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的腸上皮細(xì)胞分化。結(jié)直腸腺癌細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白Ⅱ，并呈角質(zhì)蛋白陽性。

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇結(jié)直腸腺癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）結(jié)直腸腺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.收到結(jié)直腸腺癌細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議客戶凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。

3）結(jié)直腸腺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為類；

1，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2，4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x10E6/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞可以用于具核梭桿菌通過E-cadherin促進(jìn)NCM460細(xì)胞增殖、遷移能力及炎癥因子表達(dá)

了解具核梭桿菌對人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系有無影響作用,同時,想要通過本實驗初步觀察檢測,正常腸道環(huán)境中出現(xiàn)具核梭桿菌感染后可能出現(xiàn)的細(xì)胞體液變化情況。

目前,國內(nèi)關(guān)于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系——NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌間所發(fā)揮的相關(guān)作用機(jī)制的研究尚未見報道,本研究的研究目的為:1)建立具核梭桿菌與NCM460細(xì)胞共培養(yǎng)模型,了解其是否能對NCM460細(xì)胞的增殖活性、遷移能力及炎癥因子的表達(dá)能力產(chǎn)生影響;

2) 具核梭桿菌是否通過NCM-460細(xì)胞表面E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白復(fù)合體的介導(dǎo)對細(xì)胞產(chǎn)生影響。

本研究以建立NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌的共培養(yǎng)模型作為研究切入點(diǎn),了解具核梭桿菌對人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞有無影響作用,以及具核梭桿菌與NCM460細(xì)胞相互作用的具體機(jī)制,為進(jìn)一步明確具核梭桿菌與結(jié)直腸疾病間的相關(guān)性提供理論和現(xiàn)實依據(jù)。

方法:本實驗選取人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系即NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌作為研究對象,將具核梭桿菌菌懸液與NCM460細(xì)胞分別稀釋成不同濃度,以不同比例共培養(yǎng),篩選出合適的細(xì)胞、細(xì)菌共培養(yǎng)比例,便于開展后續(xù)實驗。

部分實驗:1)細(xì)胞劃痕實驗檢測NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)后,對細(xì)胞的遷移能力的影響,并設(shè)置大腸桿菌DH5α陽性對照組及空白對照組;

2)具核梭桿菌與NCM460細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后,利用細(xì)胞計數(shù)方法及CCK-8實驗繪制細(xì)胞增殖曲線,了解細(xì)胞增殖活性改變情況,設(shè)置大腸桿菌DH5α陽性對照組及空白對照組;

3)NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)一定時間段,分別于不同時間點(diǎn)取出共培養(yǎng)樣本通過流式細(xì)胞儀檢測各實驗組中不同細(xì)胞周期細(xì)胞數(shù)所占比例,分析各實驗組中NCM460細(xì)胞通過細(xì)胞周期中的哪些增殖階段,引起細(xì)胞增殖活性的變化;

4)收集NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)后的細(xì)胞蛋白,然后通過蛋白免疫印跡法,檢測NCM460細(xì)胞中P-P56、IL-6、IL-1β、MMP-13的表達(dá)情況,了解NF-k B炎癥通路的激活情況,以及下游炎癥因子的變化。設(shè)置GAPDH作為內(nèi)參對照。

之后收集NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)后的細(xì)胞蛋白,然后采用western-blot檢測方法,觀察細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白的表達(dá)變化情況,設(shè)置GAPDH作為內(nèi)參對照;并利用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,

采用E-鈣黏蛋白si RNA或β-連環(huán)蛋白si RNA分別轉(zhuǎn)染NCM460細(xì)胞,再通過細(xì)胞免疫熒光檢測及Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白的表達(dá),確定轉(zhuǎn)染成功;E-鈣黏蛋白或β-連環(huán)蛋白沉默表達(dá)的NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)一定時間后,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞中細(xì)胞周期比例的改變,分析細(xì)胞增殖活性的具體細(xì)胞周期改變情況,并設(shè)置空白對照組;

E-鈣黏蛋白或β-連環(huán)蛋白沉默表達(dá)的NCM460細(xì)胞與具核梭桿菌共培養(yǎng)一定時間后,采用q RT-PCR的檢測方式及western-blot檢測方法,了解NCM460細(xì)胞表達(dá)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-13的表達(dá)情況,GADPH作為內(nèi)參對照,然后分析E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白在具核梭桿菌干預(yù)NCM460細(xì)胞過程中的參與機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

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[3]Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy[J].TaChung Yu;;Fangfang Guo;;Yanan Yu;;Tiantian Sun;;Dan Ma;;Jixuan Han;;Yun Qian;;Ilona Kryczek;;Danfeng Sun;;Nisha Nagarsheth;;Yingxuan Chen;;Haoyan Chen;;Jie Hong;;Weiping Zou;;Jing-Yuan Fang.Cell,2017(3)

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[5]馬春婷.具核梭桿菌通過E-cadherin促進(jìn)NCM460細(xì)胞增殖、遷移能力及炎癥因子表達(dá)[D].武漢大學(xué),2019.