背景[1-7]
Ac-VEID-pNA(Caspase 6顯色底物)是采用分光光度法檢測細(xì)胞或組織裂解液中caspase 6酶活性或純化的caspase 6酶活性的顯色底物。
原理：caspase 6可以催化底物Ac-VEID-pNA(acetyl-Val-Glu-Ilel-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 6的活性。pNA在405nm附近有強吸收。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 6也稱Mch-2，有時被寫作caspase-6或caspase 6，最初從人的Jurkat細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。
Caspase 6的前體被granzyme B剪切后可以形成活化的caspase 6二聚體，而活化的caspase 6被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase 6可以剪切PARP和keratin-18，也可以剪切細(xì)胞核核被膜上的關(guān)鍵組成蛋白Lamin A。Caspase家族中僅caspase 6可以剪切Lamin A。Caspase 6對于Lamin A的識別位點是VEID。Caspase 6在人中由編碼CASP6基因。
已在許多哺乳動物中鑒定出CASP6直向同源物，其中有完整的基因組數(shù)據(jù)。獨特的直系同源物也存在于鳥類，蜥蜴，lissamphibians和硬骨魚類中。胱天蛋白酶6已經(jīng)公知的函數(shù)的細(xì)胞凋亡，早期免疫應(yīng)答和神經(jīng)變性在亨廷頓和阿爾茨海默氏病。該基因編碼的蛋白質(zhì)是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成員。半胱氨酸蛋白酶的順序激活在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用。
半胱天冬酶作為無活性的酶原存在，在保守的天冬氨酸殘基上進(jìn)行蛋白水解加工，產(chǎn)生兩個大小的亞基，它們二聚化形成活性酶。該蛋白質(zhì)是由處理胱天蛋白酶7，8和10并且被認(rèn)為在半胱天冬酶激活級聯(lián)中起到下游酶的作用。Caspase 6也可以在沒有caspase家族其他成員的情況下進(jìn)行自我處理。該基因的可變剪接導(dǎo)致編碼不同同種型的兩種轉(zhuǎn)錄物變體。
Caspase-6通過去抑制在早期免疫反應(yīng)中起作用。它降低免疫抑制劑細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10的表達(dá)并切割抑制IRAK-M的巨噬細(xì)胞。關(guān)于神經(jīng)變性，caspase-6在亨廷頓氏病和阿爾茨海默病的APP中切割HTT。導(dǎo)致兩種情況下片段的蛋白質(zhì)聚集。
研究應(yīng)用[8]
Ac-VEID-pNA(Caspase 6顯色底物)可用于研究DR6與Caspase6在PrP106-126誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元軸突變性過程中的調(diào)控機制。prp106-126誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元軸突變性神經(jīng)元的分子機制,探索死亡受體6在軸突變性中的作用以及其下游的激活機制。結(jié)果表明：
1.脊髓神經(jīng)元在毒性多肽PrP106-126作用下,脊髓神經(jīng)元的細(xì)胞骨架嚴(yán)重受損,神經(jīng)元軸突大量消失,軸突遠(yuǎn)端微管出現(xiàn)斷裂,微管蛋白聚集明顯。表明神經(jīng)元在PrP106-126作用下,通過破壞細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)導(dǎo)致神經(jīng)元軸突發(fā)生變性。
2.脊髓神經(jīng)元在PrP106-126作用下,在神經(jīng)元軸突發(fā)生變性,在神經(jīng)元大量死亡的同時,細(xì)胞內(nèi)死亡受體6蛋白水平顯著增高。對神經(jīng)元DR6進(jìn)行敲除后,可以很好的阻止神經(jīng)元由于毒性多肽PrP106-126引起的軸突變性。我們證明DR6對脊髓神經(jīng)元軸突變性存在決定性的調(diào)控作用。
3.脊髓神經(jīng)元在PrP106-126作用下,細(xì)胞內(nèi)Caspase3、Caspase6被激活。Caspase3在神經(jīng)元胞體大量表達(dá),軸突內(nèi)幾乎無表達(dá)；Caspase6在神經(jīng)元軸突和胞體大量表達(dá)。將Caspase3、Caspase6抑制后,在PrP106-126作用下,Caspase3被抑制組的神經(jīng)元胞體基本完整但軸突發(fā)生明顯變性,Caspase6被抑制組的神經(jīng)元胞體與軸突都較為完整。Caspase3、Caspase6的SiRNA結(jié)果與抑制效果相同。結(jié)果表明,在PrP106-126作用下,Caspase6對脊髓神經(jīng)元軸突發(fā)生變性起調(diào)節(jié)作用。
4.在DR6被干擾后,神經(jīng)元的Caspase6激活也會受到抑制；PrP106-126作用于DR6干擾組神經(jīng)元也未出現(xiàn)Caspase6激活的現(xiàn)象,相似的,DR6干擾的存在也會抑制神經(jīng)元Caspase3的激活。結(jié)果表明：caspase6的細(xì)胞凋亡信號調(diào)控通路位于DR6的下游,DR6和Caspase6在軸突退化中起到調(diào)節(jié)作用。
5.PrP106-126作用的脊髓神經(jīng)元中加入Nmnatl后,可在12個小時之內(nèi)有效地保護(hù)軸突免于變性,24小時之后作用明顯減弱；但Nmnatl不能有效的抑制Caspase6的表達(dá)；因此,上述結(jié)果表明,Nmnatl對脊髓神經(jīng)元軸突的保護(hù)作用可能與Caspase6的激活通路無關(guān)。
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