背景[1-3]
人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞是由E·Klein和G·Klein于1967年5月從一位16歲黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立的。Daudi細(xì)胞表面免疫球蛋白陽性(sIg+)、Β2-微球蛋白陰性，EBNA陽性，并有衣殼抗原VCA；Daudi細(xì)胞攜帶EB病毒。Daudi細(xì)胞是典型的B淋巴母細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于白血病發(fā)生機(jī)理的研究。
人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞
人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞處理：
1）凍存人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
懸浮狀態(tài)下生長的細(xì)胞，可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細(xì)胞的生長狀態(tài)，一般情況下細(xì)胞密度維持在1×105~1×10^6個/mL（不同細(xì)胞對密度要求不同，）可以維持細(xì)胞的正常生長。如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中1000rpm，離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。
應(yīng)用[4][5]
人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞可以用于miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控Burkitt淋巴瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究
通過使用miRNA靶點分析軟件Target Scan、miRDB、microcosm、Walk3.0預(yù)測分析了miR-525-5p的靶基因,結(jié)果顯示,miR-525-5p能夠與MyD88基因的3’-UTR結(jié)合,MyD88是一種重要的銜接蛋白,它可以激活核因子-κB(NF-κB)信號通路,介導(dǎo)炎性反應(yīng),在促腫瘤方面發(fā)揮著十分重要的作用。有關(guān)miR-525-5p如何影響MyD88進(jìn)而發(fā)揮一系列作用尚未知曉,值得深入研究。
為更進(jìn)一步了解miR-525-5p的作用,探討miR-525-5p對BL細(xì)胞株的生物學(xué)行為的影響,分析miR-525-5p與MyD88之間的調(diào)控機(jī)制,本課題組提出假說“下調(diào)的miR-525-5p靶向作用于MyD88進(jìn)而活化NF-κB信號通路可能是促進(jìn)Burkitt淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一”,檢測BL中miR-525-5p miRNA和MyD88蛋白的表達(dá)水平、分析miR-525-5p對BL細(xì)胞生物學(xué)行為的影響、探討miR-525-5p對MyD88及NF-κB信號通路的調(diào)控作用、驗證MyD88是否為miR-525-5p的下游靶基因,進(jìn)一步揭示miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控BL細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。
研究方法提取石蠟包埋BL組織中RNA,采用Realtime RCR技術(shù)對miR-525-5p m RNA的表達(dá)進(jìn)行檢測;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測MyD88的蛋白表達(dá)。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-525-5p的BL Raji、Ramos細(xì)胞株,借助于Realtime RCR技術(shù)檢測miR-525-5p的轉(zhuǎn)染效率,同時檢測MyD88 m RNA的表達(dá)水平。構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-525-5p的細(xì)胞株,通過CCΚ-8法檢測細(xì)胞增殖能力變化;應(yīng)用Western Blot法對MyD88及NF-κB信號通路蛋白(p65、p-p65、IκBα、p-IκBα)的表達(dá)變化進(jìn)行觀察;應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實驗對細(xì)胞克隆形成能力進(jìn)行檢測;采用Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力;通過流式細(xì)胞術(shù)了解細(xì)胞凋亡比例變化和細(xì)胞周期分布;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析在使用化療藥物的情況下,細(xì)胞凋亡比例發(fā)生的變化。最后采用雙熒光素酶實驗分析MyD88是否為miR-525-5p的靶基因。
研究結(jié)果BL中miR-525-5p表達(dá)下調(diào),MyD88表達(dá)增高。過表達(dá)的miR-525-5p可以下調(diào)MyD88的表達(dá),并抑制NF-κB信號通路;過表達(dá)的miR-525-5p能夠使Raji、Ramos細(xì)胞在化療藥物上有更高的敏感性,還能使細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成過程受到抑制,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,改變細(xì)胞周期。
同時驗證MyD88是miR-525-5p的下游靶基因。研究結(jié)論1.miR-525-5p可以靶向結(jié)合MyD88并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。2.下調(diào)的miR-525-5p可通過MyD88活化NF-κB信號通路。3.miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控BL細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移能力,促進(jìn)BL細(xì)胞的凋亡,改變BL細(xì)胞的周期,增加BL細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
參考文獻(xiàn)
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