背景^[1-3]

人BURKITT淋巴瘤細胞是由E·Klein和G·Klein于1967年5月從一位16歲黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立的。Daudi細胞表面免疫球蛋白陽性(sIg+)、Β2-微球蛋白陰性，EBNA陽性，并有衣殼抗原VCA；Daudi細胞攜帶EB病毒。Daudi細胞是典型的B淋巴母細胞，廣泛應(yīng)用于白血病發(fā)生機理的研究。

人BURKITT淋巴瘤細胞

人BURKITT淋巴瘤細胞處理：

1）凍存人BURKITT淋巴瘤細胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）人BURKITT淋巴瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮人BURKITT淋巴瘤細胞，傳代可參考以下方法：

懸浮狀態(tài)下生長的細胞，可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細胞的生長狀態(tài)，一般情況下細胞密度維持在1×105~1×10^6個/mL（不同細胞對密度要求不同，）可以維持細胞的正常生長。如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中1000rpm，離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）人BURKITT淋巴瘤細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

應(yīng)用^[4][5]

人BURKITT淋巴瘤細胞可以用于miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控Burkitt淋巴瘤細胞生物學(xué)行為的研究

通過使用miRNA靶點分析軟件Target Scan、miRDB、microcosm、Walk3.0預(yù)測分析了miR-525-5p的靶基因,結(jié)果顯示,miR-525-5p能夠與MyD88基因的3’-UTR結(jié)合,MyD88是一種重要的銜接蛋白,它可以激活核因子-κB(NF-κB)信號通路,介導(dǎo)炎性反應(yīng),在促腫瘤方面發(fā)揮著十分重要的作用。有關(guān)miR-525-5p如何影響MyD88進而發(fā)揮一系列作用尚未知曉,值得深入研究。

為更進一步了解miR-525-5p的作用,探討miR-525-5p對BL細胞株的生物學(xué)行為的影響,分析miR-525-5p與MyD88之間的調(diào)控機制,本課題組提出假說“下調(diào)的miR-525-5p靶向作用于MyD88進而活化NF-κB信號通路可能是促進Burkitt淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的機制之一”,檢測BL中miR-525-5p miRNA和MyD88蛋白的表達水平、分析miR-525-5p對BL細胞生物學(xué)行為的影響、探討miR-525-5p對MyD88及NF-κB信號通路的調(diào)控作用、驗證MyD88是否為miR-525-5p的下游靶基因,進一步揭示miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控BL細胞生物學(xué)行為的機制。

研究方法提取石蠟包埋BL組織中RNA,采用Realtime RCR技術(shù)對miR-525-5p m RNA的表達進行檢測;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測MyD88的蛋白表達。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定過表達miR-525-5p的BL Raji、Ramos細胞株,借助于Realtime RCR技術(shù)檢測miR-525-5p的轉(zhuǎn)染效率,同時檢測MyD88 m RNA的表達水平。構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-525-5p的細胞株,通過CCΚ-8法檢測細胞增殖能力變化;應(yīng)用Western Blot法對MyD88及NF-κB信號通路蛋白(p65、p-p65、IκBα、p-IκBα)的表達變化進行觀察;應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實驗對細胞克隆形成能力進行檢測;采用Transwell法檢測細胞遷移能力;通過流式細胞術(shù)了解細胞凋亡比例變化和細胞周期分布;應(yīng)用流式細胞術(shù)分析在使用化療藥物的情況下,細胞凋亡比例發(fā)生的變化。最后采用雙熒光素酶實驗分析MyD88是否為miR-525-5p的靶基因。

研究結(jié)果BL中miR-525-5p表達下調(diào),MyD88表達增高。過表達的miR-525-5p可以下調(diào)MyD88的表達,并抑制NF-κB信號通路;過表達的miR-525-5p能夠使Raji、Ramos細胞在化療藥物上有更高的敏感性,還能使細胞的增殖、遷移、克隆形成過程受到抑制,促進細胞的凋亡,改變細胞周期。

同時驗證MyD88是miR-525-5p的下游靶基因。研究結(jié)論1.miR-525-5p可以靶向結(jié)合MyD88并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。2.下調(diào)的miR-525-5p可通過MyD88活化NF-κB信號通路。3.miR-525-5p通過MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控BL細胞的增殖、克隆形成、遷移能力,促進BL細胞的凋亡,改變BL細胞的周期,增加BL細胞對化療藥物的敏感性。

參考文獻

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[3]Alleviation of non-alcoholic fatty liver disease by Huazhi Fugan Granules is associated with suppression of TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Ye Miaoqing;Tang Yinghui;He Jinyu;Yang Yueqing;Cao Xueyan;Kou Shaojie;Wang Lin;Sheng Lingli;Xue Jingdong.Clínica e Investigación en Arteriosclerosis,2021(prep)

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