背景[1-3]
大鼠主動脈平滑肌細胞是以大鼠主動脈為材料經(jīng)過酶消化制的原代成纖維細胞細胞系。血管平滑肌細胞是許多重大動脈疾病的細胞底物。血管平滑肌細胞的不斷增長是損傷性血管病變形成、動脈疾病發(fā)展的重要原因。體外培養(yǎng)血管平滑肌細胞是研究在血管病變發(fā)生過程中細胞及分子改變的基礎。此外平滑肌細胞具有產(chǎn)生結締組織和基質(zhì)的功能，因此動脈平滑肌細胞是研究動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄以及高血壓等疾病發(fā)病機制和防治工作的重要對象。
大鼠主動脈平滑肌細胞
大鼠主動脈平滑肌細胞分離步驟：
1、頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精浸泡3～5min，無菌條件下打開胸腔，將大鼠左肺向右側翻轉，可見貼于脊柱右側胸主動脈走行。上端沿主動脈弓，下端至膈的主動脈裂孔處，完整剪取胸主動脈，置于預先裝有PBS的無菌培養(yǎng)皿中；
2、用鑷子輕輕剝離血管外結締姐織，移至另一裝有PBS的無菌培養(yǎng)皿；
3、用眼科剪沿縱軸剪開血管條，無菌鑷輕輕刮除內(nèi)膜，移至另一無菌培養(yǎng)皿；
4、用鑷子鈍性加壓刮中膜2次，待出現(xiàn)裂口后夾住中膜將其取下；
5、將取下的中膜加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，用眼科剪剪碎血管條，使組織塊大小約1mm×1mm×lmm;
6、用無菌滴管將組織塊吸入細胞培養(yǎng)瓶，均勻鋪于瓶壁，間距約0.2～0.5cm;
7、將培養(yǎng)瓶直立放置于37℃/5%CO2細胞培養(yǎng)箱；
8、1h后輕輕放平，37℃/5%CO2細胞培養(yǎng)箱中絕對靜置3d;
9、此后每3d換液1次；
10、培養(yǎng)出來的VSMC及時傳代及凍存于液氮，3～8代用于后續(xù)實驗。
應用[4][5]
大鼠主動脈平滑肌細胞可以用于法舒地爾對大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的影響及Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的作用
通過觀察法舒地爾對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響并探討其可能的分子生物學機制。以求進一步了解法舒地爾對血管再狹窄藥理作用，并期望其能成為預防治療動脈狹窄介入術后再狹窄的新型藥物。
方法:提取培養(yǎng)SD大鼠主動脈血管平滑肌細胞，待細胞生長至70%80%匯合后換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，使細胞處于靜止期，然后換用含10%FBS的培養(yǎng)液，分別加入不同濃度(1,10,100μmol/L)的法舒地爾孵育48h，收集細胞用于下列實驗。實驗共分為五組：A組：無血清組；B組：血清組；C組：血清+1μmol/L法舒地爾干預組；D組：血清+10μmol/L法舒地爾干預組；E組：血清+100μmol/L法舒地爾干預組。通過MTT法，BrdU法及劃痕試驗測定血管平滑肌細胞的增殖和遷移；應用流式細胞法測定血管平滑肌細胞周期及細胞凋亡；應用Western免疫印跡法測定Ras-MEK1/2-ERK1/2以及Akt蛋白通路的磷酸化水平。
結果：(1)法舒地爾以劑量依賴性方式抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移：MTT檢測結果表明，法舒地爾可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖，并具有明顯的量效關系(P<0.05)。在法舒地爾1,10,100μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，VSMC的增殖活力逐漸下降，與對照組相比，分別下降2.04%,8.98%,30.39%(24h);6.17%,23.36%,59.82%(48h)。BrdU檢測結果表明，法舒地爾可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖，并具有明顯的量效關系(P<0.05)。在法舒地爾1,10,100μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，VSMC的增殖活力逐漸下降，與血清組相比，分別下降9.94%39.36%49.37%(24h);7.38%,57.26%,70.74%(48h).
(2) 法舒地爾以劑量依賴性方式阻斷細胞周期從G0/G1期過度到S期：分別用1、10、100μmol/L法舒地爾作用于VSMC24h,G0/G1期細胞逐漸增多(5.1%,14.2%,22.4%)，S期細胞逐漸減少(3.9%，14.8%，19.1%)，表明法舒地兒可抑制血管平滑肌細胞進入S期(P<0.05)。
(3) 法舒地爾以劑量依賴性方式抑制血管平滑肌細胞早期凋亡和晚期細胞凋亡：法舒地爾對細胞凋亡的影響通過流式細胞術測定，結果顯示：1、10、100μmol/L法舒地爾作用VSMC48h,早期凋亡及晚期凋亡細胞逐漸增多，并隨劑量的增加而遞增。表明法舒地爾可促進血管平滑肌細胞凋亡(P<0.05)。
(4) 法舒地爾以劑量依賴性方式通過抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路起到其抗增殖效果：通過10%FBS刺激誘導Ras通路激活后加入法舒地爾，結果顯示：Ras通路的表達明顯減少，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(P<0.05)。
作為Ras下游的激酶，我們也檢測了磷酸化和非磷酸化的MEK1/2和ERK1/2的蛋白表達，結果顯示：應用法舒地爾后，以劑量依賴的形式抑制了MEK1/2和ERK1/2通路的磷酸化表達(P<0.05)，另外，P13k-Akt通路也顯示可以介導FBS誘導的血管平滑肌細胞的遷移和增殖，法舒地爾是否通過這一通路起作用在本研究中被調(diào)查，結果顯示：FBS誘導了Akt的激活，但應用法舒地爾后沒有發(fā)現(xiàn)其對Akt磷酸化的抑制效果(P>0.05).
結論:法舒地爾通過對Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的抑制作用以及對細胞凋亡的促進作用實現(xiàn)對血管平滑肌細胞增殖的抑制。
參考文獻
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