背景[1-3]
小鼠黑色素瘤細(xì)胞是B16-F0細(xì)胞的亞系，源自黑色素瘤C57BL/6J荷瘤小鼠的皮膚；B16-F1細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素。
小鼠黑色素瘤細(xì)胞
小鼠黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作:
1)復(fù)蘇小鼠黑色素瘤細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)小鼠黑色素瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)小鼠黑色素瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
小鼠黑色素瘤細(xì)胞可以用于SHCBP1介導(dǎo)白藜蘆醇調(diào)控小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制研究
基于前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中SHCBP1的表達(dá)水平的結(jié)果,采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、Ed U染色等方法闡明白藜蘆醇在抑制小鼠黑色素瘤(B16)細(xì)胞的分子機(jī)制,并進(jìn)一步闡明SHCBP1在B16細(xì)胞中的生物學(xué)作用。
本研究主要獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、白藜蘆醇抑制B16細(xì)胞增殖、細(xì)胞集落形成和細(xì)胞遷移。這種影響是由于白藜蘆醇抑制B16細(xì)胞中ERK及AKT信號(hào)通路,并促進(jìn)細(xì)胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制B16細(xì)胞中SHCBP1蛋白的表達(dá)。
2、SHCBP1在B16細(xì)胞中本底表達(dá)較高。通過獲得干擾SHCBP1的B16細(xì)胞株,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異基因KEGG通路,發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在細(xì)胞增殖、凋亡、氧化及炎癥相關(guān)通路,說明SHCBP1的確影響B(tài)16細(xì)胞增殖。
3、在B16細(xì)胞中單獨(dú)干擾和超表達(dá)SHCBP1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHCBP1加速B16細(xì)胞G1/S期進(jìn)程,促進(jìn)ERK和AKT的磷酸化,進(jìn)一步影響Cyclin D1和P21的表達(dá)水平,從而調(diào)控細(xì)胞增殖過程。
4、分別在SHCBP1干擾和超表達(dá)的情況下,用白藜蘆醇處理B16細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇抑制SHCBP1的表達(dá),調(diào)控ERK信號(hào)通路從而影響B(tài)16細(xì)胞的細(xì)胞增殖,另一方面,白藜蘆醇也通過AKT信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控B16細(xì)胞增殖效應(yīng)。
結(jié)論:本研究闡明白藜蘆醇通過抑制SHCBP1/ERK和AKT信號(hào)通路抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖及遷移能力。為白藜蘆醇臨床治療提供實(shí)驗(yàn)支撐,SHCBP1作為治療黑色素瘤的臨床診斷和靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
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