研究背景
螺旋霉素(spiramycin)是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對治療感染性疾病具有臨床應(yīng)用價(jià)值。乙酸激酶、?；鵆oA合成酶及堿性磷酸酶 的酶活力提高，可促進(jìn)生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)中短鏈脂肪酸的生成，而較高濃度的短鏈脂肪酸可刺激螺旋霉素的生物合成。過量銨離子會抑制上述3種酶及螺旋霉素的合成，加入脂肪酸可降低該負(fù)效應(yīng)。在很多微生物研究中，吐溫系列產(chǎn)品作為一種非離子表面活性劑應(yīng)用于細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)，促進(jìn)膜對離子的通透性。吐溫85，是含有烯鍵的聚不飽和脂肪酸，不溶于水，但可在水中分散，具有潤濕、擴(kuò)散等性能。
研究內(nèi)容
1、發(fā)酵培養(yǎng)
將甘油管中的菌體按6％接種量接入裝量為60ml的500ml一級種子瓶，(27±0.5)℃培養(yǎng)42h后按相同接種量接入裝量為60ml的500ml二級種子瓶，同溫培養(yǎng)24h。再按6％接種量接入裝量為7L的10L種子罐，同溫培養(yǎng)24h后按相同接種量接入裝量為10L的15L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
2、吐溫85對螺旋霉素的影響
搖瓶實(shí)驗(yàn)篩選不同的表面活性劑，選出吐溫85作為添加劑。進(jìn)一步摸索添加時(shí)間和添加量，確定0h添加100mg/L ，螺旋霉素的發(fā)酵效價(jià)達(dá)22166u/ml，較對照(20416u/ml)提高了8.57％。將該結(jié)論應(yīng)用至15L發(fā)酵罐上，0h時(shí)向試驗(yàn)罐中加入100mg/L吐溫85，以不加吐溫85為對照。結(jié)果表明，試驗(yàn)罐初始效價(jià)較低，至100h時(shí)與對照罐基本一致；到發(fā)酵后期，其效價(jià)達(dá)28176u/ml，較對照罐(25179u/ml)提高了11.9％。 通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)加入吐溫85會造成菌絲空泡多、舒展?fàn)顟B(tài)不佳，因此總糖和氨基氮消耗少，菌體生長時(shí)間延長，補(bǔ)料時(shí)間隨之推遲，較晚進(jìn)入次級代謝，造成起始效價(jià)低。
3、吐溫85對細(xì)胞通透性的影響
HPLC檢測胞內(nèi)螺旋霉素，發(fā)現(xiàn)對照罐在56h和115h胞內(nèi)有螺旋霉素的積累高峰，分別達(dá)2576和2710u/(g蛋白)， 而試驗(yàn)罐為970和2421u/(g蛋白)(為排除菌體生長差異，以單位蛋白表示)。且在整個(gè)發(fā)酵過程中，試驗(yàn)罐胞內(nèi)螺旋霉素的效價(jià)始終低于對照罐。說明添加吐溫85增加了細(xì)胞的通透性，利于螺旋霉素分泌到胞外。
4、吐溫85對乙酸激酶、?；鵆oA合成酶和堿性磷酸酶酶活力的影響
在56h時(shí)試驗(yàn)罐的乙酸激酶和堿性磷酸酶有一酶活力峰，分別為359和 0.054u/(mg蛋白)，此時(shí)菌體處于生長階段，大量消耗無機(jī)磷，并產(chǎn)生大量菌體所需的乙酰CoA。由于吐溫85對菌體有損害，造成前期這兩個(gè)酶的活力不高。進(jìn)入次級代謝后，三個(gè)酶的酶活力在115~139h達(dá)到高峰。從127h起，試驗(yàn)罐中?；鵆oA合成酶的酶活力一直高于對照，139h時(shí)達(dá)到32.8u/(mg蛋白)[對照罐為 26.9u/(mg蛋白)]，約提高了22％。堿性磷酸酶在127h 時(shí)酶活力達(dá)0.1u/(mg蛋白)，為對照[0.083u/(mg蛋白)] 的120.5％。
5、添加吐溫85對有機(jī)酸的影響
除琥珀酸和乙酸，試驗(yàn)罐其余所測得有機(jī)酸含量均約為對照罐的70％，且變化趨勢基本一致(數(shù)據(jù)未列出)。試驗(yàn)罐中琥珀酸有積累，其胞內(nèi)含量是檸檬酸和蘋果酸的兩倍。琥珀酸可提供丙酸，且琥珀酰CoA與琥珀酸之間的轉(zhuǎn)化是可逆的，因此琥珀酸的積累意味著可提供足夠的琥珀酰CoA，即可提供螺旋霉素大環(huán)合成所需的前體—甲基丙二酰CoA。琥珀酸的趨勢變化主要來自胞內(nèi)（圖1），說明吐溫85的添加引起了細(xì)胞內(nèi)代謝的變化。試驗(yàn)罐中后期積累的琥珀酸量相對更多，消耗較快，因此可提供較多的前體。
結(jié)論
吐溫85可以增加細(xì)胞膜的通透性，提高乙酸激酶、?；鵆oA合成酶和堿性磷酸酶的酶活力，并促進(jìn)菌體對油的利用，提供更多的前體，從而提高螺旋霉素的產(chǎn)量。
參考文獻(xiàn)
［1］朱鳳,陳長華,張琪. 吐溫-85對螺旋霉素發(fā)酵過程的影響[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2008,39(3):176-178.