背景[1-3]
大鼠乳腺上皮細(xì)胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過(guò)上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)。大鼠乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)Cytokeratin-18（CK18）或PCK(Pan Cytokeratin)免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，細(xì)胞活性良好，不含細(xì)菌、真菌、支原體、傳染性病毒等。
大鼠乳腺上皮細(xì)胞
大鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法：
1、收到大鼠乳腺上皮細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
2、大鼠乳腺上皮細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3、大鼠乳腺上皮細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4、大鼠乳腺上皮細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
應(yīng)用[4][5]
大鼠乳腺上皮細(xì)胞可以用于當(dāng)歸芍藥散加味對(duì)乳腺增生模型大鼠乳腺上皮細(xì)胞let-7、p-ERK表達(dá)的影響研究
通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)歸芍藥散加味方對(duì)乳腺增生大鼠乳腺上皮細(xì)胞p-ERK、let-7基因表達(dá)的影響,并對(duì)大鼠乳腺組織進(jìn)行病理學(xué)觀察,探討當(dāng)歸芍藥散加味方對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增值分化及凋亡的影響,為中醫(yī)藥從調(diào)理肝脾法治療乳腺增生病及防治乳腺癌提供一定的科學(xué)依據(jù)。
方法:SD雌性未孕健康大鼠72只,體重180-200克,通過(guò)自由飲水進(jìn)食、自然光照,適應(yīng)環(huán)境1周后,如無(wú)異常表現(xiàn),采用分層隨機(jī)法,將72只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組16只,實(shí)驗(yàn)組56只。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠采用雌、孕激素聯(lián)合造模,一個(gè)月后,實(shí)驗(yàn)組大鼠再隨機(jī)分為模型1組、模型2組、乳癖消組、當(dāng)歸芍藥散加味組,每組14只。同時(shí)處死模型1組大鼠,并將其第2、3對(duì)乳房完整剝離做病理切片,置于高倍顯微鏡下觀察其組織學(xué)變化,以確定大鼠乳腺增生病理模型是否成功。
造模成功后,治療組予以當(dāng)歸芍藥散加味生藥提取液灌服,劑量10ml/kg/天,連續(xù)30天;治療對(duì)照組以0.3g/kg乳癖消混懸液灌服,連續(xù)30天;空白組對(duì)照組和模型2組分別以生理鹽水灌胃,劑量10ml/kg/天,連續(xù)30天。連續(xù)灌胃一個(gè)月后,觀察各組大鼠一般情況,處死全部實(shí)驗(yàn)大鼠并留取大鼠乳腺組織標(biāo)本,測(cè)量大鼠乳頭直徑及高度變化;免疫組化法測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞let-7基因表達(dá)與p-ERK蛋白表達(dá),比較其差異性;對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乳腺病理組織學(xué)進(jìn)行比較分析。
結(jié)果:模型組、乳癖消組、當(dāng)歸芍藥散加味組的大鼠乳頭直徑、高度均大于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當(dāng)歸芍藥散加味組大鼠乳頭直徑、高度均小于模型組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組與當(dāng)歸芍藥散加味組大鼠乳頭直徑、高度無(wú)顯著性差異,P>0.05。模型組、乳癖消組、當(dāng)歸芍藥散加味組的大鼠p-ERK基因表達(dá)量均大于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當(dāng)歸芍藥散加味組大鼠p-ERK基因表達(dá)量均小于模型組,差異非常顯著,P<0.01;當(dāng)歸芍藥散加味組p-ERK基因表達(dá)量低于乳癖消組,差異非常顯著,P<0.01;模型組、乳癖消組、當(dāng)歸芍藥散加味組的大鼠let-7基因表達(dá)量均小于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當(dāng)歸芍藥散加味組大鼠let-7基因表達(dá)量均大于模型組,差異非常顯著,P<0.01;當(dāng)歸芍藥散加味組let-7基因表達(dá)量高于乳癖消組,差異非常顯著,P<0.01;
結(jié)論:當(dāng)歸芍藥散加味方可減輕大鼠乳腺增生、腫大狀態(tài),改善局部乳腺組織水腫,達(dá)到減輕乳腺增生的作用,同時(shí)對(duì)乳腺增生上皮細(xì)胞有促進(jìn)let-7基因表達(dá)、抑制p-ERK蛋白表達(dá)的作用,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、分化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,改善乳腺組織增生狀態(tài)。其機(jī)理可能是當(dāng)歸芍藥散加味方具有養(yǎng)血疏肝,利濕健脾,活血散結(jié)之功效,可調(diào)節(jié)機(jī)體氣血陰陽(yáng)的動(dòng)態(tài)平衡,從而達(dá)到治療和改善乳腺增生病的目的。
參考文獻(xiàn)
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[5]王婷.當(dāng)歸芍藥散加味對(duì)乳腺增生模型大鼠乳腺上皮細(xì)胞let-7、p-ERK表達(dá)的影響研究[D].福建中醫(yī)藥大學(xué),2018.