背景^[1-3]

A-427人肺腺癌細胞系是一種人肺腺癌細胞系，由Giard·D·J建立，源自一位52歲的肺癌男性白人患者。該細胞系具有貼壁細胞生長特性，細胞形態(tài)為上皮細胞樣。在培養(yǎng)基方面，A-427細胞系可采用含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基，并可添加1%的青霉素/鏈霉素。在傳代過程中，推薦傳代比例為1:2-1:4，并每2~3次/周進行換液。

A-427人肺腺癌細胞系

A-427人肺腺癌細胞系操作規(guī)程：

一．A-427人肺腺癌細胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．A-427人肺腺癌細胞系細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

A-427人肺腺癌細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識。明舟生物（mingzhoubio）按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。

應(yīng)用^[4-5]

A-427人肺腺癌細胞系可以用于GRK6基因在肺腺癌中的作用及機制研究

明確人肺腺癌中GRK6基因的表達情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,闡明GRK6在肺腺癌中表達下調(diào)的可能原因以及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa對其相關(guān)調(diào)控機制,探討C/EBPa/GRK6信號通路在肺腺癌細胞遷移侵襲中的作用。

研究方法:1、用免疫組化法測定包含122例肺腺癌和45例正常肺組織的組織芯片GRK6基因蛋白表達,蛋白免疫印跡檢測18例新鮮肺腺癌組織標(biāo)本和鄰近的非癌肺組織標(biāo)本的蛋白表達,qPCR測定20例新鮮肺腺癌患者癌組織中及匹配的鄰近的非癌肺組織標(biāo)本中GRK6基因的mRNA。統(tǒng)計分析GRK6蛋白表達水平與相關(guān)臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系;

2、應(yīng)用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鹽測序PCR檢測54例肺腺癌臨床標(biāo)本中GRK6基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),分析GRK6基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,并應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序PCR檢測肺癌細胞系A(chǔ)549、A-427人肺腺癌細胞系、H1299和支氣管細胞系16HBE中GRK6基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),進一步應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理肺癌細胞后觀察GRK6基因表達水平的變化;

3、應(yīng)用生物信息學(xué)及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)探索并驗證可能參與調(diào)控GRK6基因表達的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPa,利用野生型和突變型的GRK6啟動子構(gòu)建重組質(zhì)粒,并進行熒光素酶報告基因檢測以研究C/EBPa與GRK6可能的結(jié)合位點對GRK6基因轉(zhuǎn)錄的影響。利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測肺腺癌組織和鄰近的非癌肺組織中C/EBPa和GRK6基因啟動子之間的結(jié)合情況。對肺癌細胞系A(chǔ)549應(yīng)用5-氮雜-2’-脫氧胞苷進行去甲基化處理,染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測C/EBPa和GRK6基因啟動子區(qū)結(jié)合變化情況;

4、通過沉默及過表達C/EBPa觀察GRK6的表達,通過沉默及過表達GRK6觀察肺腺癌細胞遷移與侵襲能力的變化,調(diào)控肺癌細胞A549及H1299的GRK6表達水平觀察EMT相關(guān)標(biāo)記物E-鈣黏蛋白和波形蛋白水平的變化,過表達肺癌細胞A549的GRK6水平,觀察MMP2、MMP7水平的變化。

研究結(jié)果:1、GRK6基因表達水平在肺腺癌組織中顯著下調(diào),GRK6陽性染色主要位于肺腺癌細胞的細胞質(zhì)中。GRK6表達水平與肺腺癌患者的臨床分期及腫瘤組織病理分級顯著相關(guān),但與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)性;Cox比例風(fēng)險模型多變量分析顯示,GRK6表達(P=0.004)和病理分級(P<0.001)是患者總生存期的獨立預(yù)后指標(biāo)。Kaplan-Meier生存分析表明,GRK6的低表達與肺腺癌患者總體生存率差有顯著相關(guān)性(P<0.001);

2、MSP發(fā)顯示54例肺腺癌患者中有42例患者的癌組織GRK6啟動子區(qū)甲基化為高甲基化和部分甲基化,并且甲基化水平與病理分化程度有相關(guān)性(P=0.024),但GRK6啟動子區(qū)甲基化水平與年齡、性別、吸煙情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期無相關(guān)性;Kaplan-Meier生存分析顯示,在不同甲基化水平的三組患者之間其OS存在差異(P=0.027),但是在無甲基化和部分甲基化組間的OS沒有差異(P=0.492);BSP方法檢測發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織和鄰近非腫瘤組織GRK6基因啟動子區(qū)CpG位點的甲基化頻率分別為52±7.8%和23±6.5%,肺腺癌組織GRK6基因啟動子區(qū)甲基化水平明顯高于鄰近非腫瘤組織;

3、GRK6基因在肺癌細胞系A(chǔ)549和A-427人肺腺癌細胞系中的mRNA水平明顯低于支氣管細胞系16HBE,GRK6在肺癌細胞系H1299中的mRNA水平與16HBE細胞相比無差異,進一步應(yīng)用BSP檢測上述四種細胞系中GRK6基因啟動子區(qū)的甲基化水平顯示為:A549細胞系中GRK6基因啟動子區(qū)域的甲基化程度為(63.9%),在A-427人肺腺癌細胞系中為(56.7%),在H1299細胞系中(26.7%)及16HBE細胞系中甲基化程度較低(15.6%);采用5-氮雜-2’-脫氧胞苷對肺癌細胞進行去甲基化處理后,A549和A-427人肺腺癌細胞系細胞中GRK6表達上調(diào)；

參考文獻

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