背景[1-3]
人角膜內皮細胞是指人類眼球中位于角膜表面的一層細胞，具有重要的生理功能。它們可以分泌一些生物活性物質，如神經生長因子、血管生成素等，參與調節(jié)眼壓、促進角膜上皮細胞的修復和再生等過程。此外，人角膜內皮細胞還被廣泛應用于醫(yī)學和生物學研究中，用于研究角膜疾病、藥物篩選等方面。
人角膜內皮細胞
人角膜內皮細胞培養(yǎng)操作：
1)復蘇人角膜內皮細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)人角膜內皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)人角膜內皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。
b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應用[4][5]
人角膜內皮細胞可以用于LIF-JAK1-STAT3信號通路延遲人角膜內皮細胞接觸抑制作用機制研究
探究人角膜內皮細胞在改良胚胎干細胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)中能持續(xù)增殖并延遲接觸抑制的相關機制。
方法：通過比較人角膜內皮單層細胞在SHEM,ESCM,ESCM+LIF,ESCM+bFGF和MESCM等不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)第7,21,35和42天后5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色情況來判斷人角膜內皮細胞在不同環(huán)境下的增殖能力。并通過qRT-PCR檢測和定量分析胚胎干細胞標志物,神經嵴細胞標志物,骨形成蛋白配體和受體以及細胞周期相關基因的表達情況。通過共聚焦熒光染色顯微鏡等技術觀察相關信號通路關鍵蛋白在細胞不同部位的表達情況,從而明確人角膜內皮細胞延遲接觸抑制的相關信號通路機制。
結果：人角膜內皮細胞在SHEM培養(yǎng)基中第21天時5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色陰性,而在ESCM+LIF和MESCM中第35天時仍染色陽性。另外,在ESCM中添加白血病抑制因子(LIF,leukemia inhibitory factor)不僅和MESCM一樣可以明顯增加其中7種胚胎干細胞和神經嵴細胞標志物的表達,還可以明顯增加Oct4,Rexl和SSEA4等胚胎干細胞標志物的表達。
在ESCM中單獨或同時添加LIF和bFGF都不足以激活經典或非經典的BMP信號通路。進一步分析發(fā)現磷酸化的STAT3核轉位只有在包含LIF的培養(yǎng)基中才存在,提示LIF激活了培養(yǎng)的人角膜內皮細胞中的LIF-JAK1-STAT3信號通路。第35天時通過JAK1和STAT3siRNA的基因敲減技術處理可以消除人角膜內皮細胞在LIF包含的培養(yǎng)基中陽性的5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色和G1/S細胞周期相關基因p-Rb等的核轉位,進一步證實延遲人角膜內皮細胞的接觸抑制確實受LIF-JAK1-STAT3信號通路的調控。
結論：和SHEM相比,MESCM培養(yǎng)基可以通過延遲人角膜內皮細胞接觸抑制的重建促進角膜內皮細胞的體外增殖生長。其中LIF而不是bFGF可以激活LIF-JAK1-STAT3信號通路并通過促進G1/s細胞周期正向基因的表達,從而達到延遲人角膜內皮細胞接觸抑制的作用。
參考文獻
[1]JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming.Yong Tang;;Xiuchun(Cindy)Tian.JAK-STAT,2013
[2]Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.Ying-Ting Zhu;;Hung-Chi Chen;;Szu-Yu Chen;;Scheffer C.G.Tseng.Journal of Cell Science,2012
[3]Proliferative capacity of corneal endothelial cells.Nancy C.Joyce.Experimental Eye Research,2011
[4]Methods being developed for preparation,delivery and transplantation of a tissue-engineered corneal endothelium.Stéphanie Proulx;;Isabelle Brunette.Experimental Eye Research,2011
[5]劉欣.LIF-JAK1-STAT3信號通路延遲人角膜內皮細胞接觸抑制作用機制研究[D].華中科技大學,2016.