背景^[1-3]

SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系是一種人類骨髓增生異常綜合征的細(xì)胞系，它是由一名患有骨髓增生異常綜合征的患者中分離出來(lái)的。這種細(xì)胞系在腫瘤學(xué)研究中具有重要價(jià)值，因?yàn)樗梢杂糜谠u(píng)估新的治療方法和藥物的有效性，以及研究骨髓增生異常綜合征的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系

SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)方法：

1、SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

應(yīng)用^[4-5]

SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系可以用于ATPR通過(guò)上調(diào)RNA解旋酶DDX23誘導(dǎo)人骨髓增生異常綜合征SKM-1細(xì)胞系分化的研究

選用了SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析基因差異表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)觀察在ATPR對(duì)于ATP依賴性的RNA解旋酶DDX23表達(dá)的影響以及DDX23在ATPR誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞分化的過(guò)程中所發(fā)揮的作用。

1. ATPR對(duì)SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系的分化及周期影響分別通過(guò)采用在濃度不同(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M)的條件下和差異時(shí)間點(diǎn)(24、48、72h)作用下的ATPR對(duì)SKM-1細(xì)胞進(jìn)行處理,然后使用CCK-8法檢測(cè)SKM-1細(xì)胞增殖活性變化,確定ATPR對(duì)SKM-1細(xì)胞的作用條件。之后分別用western blot分析分化蛋白P27,PU.1在不同條件下的表達(dá)變化;給予ATPR(10-6 M)作用于SKM-1細(xì)胞72h后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。結(jié)果提示:ATPR可以在體外增加SKM-1細(xì)胞中分化蛋白的表達(dá),其中藥物在作用濃度為10-6 M,作用時(shí)間為72h時(shí)效果較為顯著;同時(shí)流式結(jié)果表明ATPR可以阻滯SKM-1細(xì)胞于G1期。

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析ATPR作用于SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系的結(jié)果給予ATPR(10-6 M)作用于SKM-1細(xì)胞72h后收集細(xì)胞,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)機(jī)定量技術(shù)(Label-Free),通過(guò)對(duì)比MS圖譜,再整合到相應(yīng)蛋白,實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)在不同樣本中的相對(duì)達(dá)水平的定量分析,最后分析出ATPR作用與SKM-1細(xì)胞后的蛋白表達(dá)差異情況并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果提示:共篩選出差異大于1.2倍的上調(diào)蛋白212個(gè)以及差異小于5/6倍的下調(diào)蛋白18個(gè),經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果屬實(shí),其中以ATP依賴性的RNA解旋酶DDX23在ATPR作用于SKM-1細(xì)胞時(shí)所產(chǎn)生的影響。

3. DDX23在ATPR誘導(dǎo)SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系分化過(guò)程中的作用將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒GV146-DDX23轉(zhuǎn)染進(jìn)入SKM-1細(xì)胞中,再使用ATPR(10-6 M)對(duì)轉(zhuǎn)染后的SKM-1細(xì)胞進(jìn)行刺激,使用western blot技術(shù)對(duì)于細(xì)胞中DDX23、P27、PU.1、PCNA、CDK4和CDK2蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);使用瑞姬氏染色檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面單核系分化抗原CD14的表達(dá)變化。

結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)DDX23可以進(jìn)一步促進(jìn)ATPR作用后所引起的SKM-1細(xì)胞中CDK2、CDK4和PCNA的表達(dá)量下降,而PU.1和p27的蛋白表達(dá)量變化則是相反。同時(shí)過(guò)表達(dá)DDX23也可以進(jìn)一步增強(qiáng)ATPR誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)改變以及SKM-1細(xì)胞表面單核系分化抗原CD14的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)DDX23的作用,我們通過(guò)使用si RNA-DDX23沉默SKM-1細(xì)胞中DDX23的表達(dá),再使用western blot技術(shù)對(duì)于細(xì)胞中DDX23、P27、PU.1、PCNA、CDK4和CDK2蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);使用瑞姬氏染色檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面單核系分化抗原CD14的表達(dá)變化。

結(jié)果顯示:沉默DDX23可以使SKM-1人骨髓增生異常綜合征貼壁細(xì)胞系中p27、PU.1的表達(dá)量下降,同時(shí)略增了CDK2、CDK4和PCNA的表達(dá)。并且沉默DDX23會(huì)拮抗ATPR誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞形態(tài)向成熟方向分化以及下調(diào)SKM-1細(xì)胞中表面單核系分化抗原CD14的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

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