背景[1-3]
CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系是一種來源于人類胰腺癌的貼壁細胞系。這些細胞系是通過將胰腺癌組織樣本移植到實驗室培養(yǎng)皿中，并使用特定的生長條件和培養(yǎng)基來分離和培養(yǎng)的。
CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系通常用于研究胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療。這些細胞系可以提供一個體外模型，用于評估新的抗癌藥物的療效，以及研究腫瘤細胞的生物學特性和分子機制。
在臨床實踐中，醫(yī)生可能會使用CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系進行診斷和治療決策。例如，通過分析這些細胞系的基因表達譜，可以幫助確定患者的癌癥類型和分級，從而指導個體化的治療方案。此外，研究人員還可以利用這些細胞系進行藥物篩選和毒性測試，以尋找新的抗癌藥物或治療方法。
CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系
一．CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備1640（推薦YJ-0002）培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
1.細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
應用[4-5]
CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系可以用于KRT18增強c-Myc通路促進胰腺癌增殖、侵襲、轉移的分子機制研究
收集36對未經放化療的新鮮胰腺癌及癌旁組織樣本,通過Western blot實驗和免疫組化實驗檢測本研究中KRT18的表達量。在胰腺正常細胞HPNE和4種胰腺癌細胞As PC-1、CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系、PANC-1、SW1990中通過q PCR實驗和Western blot實驗檢測KRT18基因m RNA和蛋白表達水平。為進一步研究KRT18對胰腺癌細胞惡性表型的影響。
本研究使用si RNA(si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3)分別轉染As PC-1細胞和CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞。通過q PCR和Western blot實驗檢測si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3在As PC-1細胞和CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞中的敲減效率。為了明確KRT18對胰腺癌細胞增殖的影響,我們首先觀察在細胞轉染了KRT18 sh RNA后的CCK-8實驗和克隆形成實驗的變化。
為了明確KRT18對胰腺癌細胞遷移的影響,我們觀察在細胞轉染了KRT18 sh RNA后的傷口愈合實驗的變化。為了明確KRT18對胰腺癌細胞侵襲的影響,我們觀察在細胞轉染了KRT18 sh RNA后的Transwell實驗的變化。EMT通路是在癌細胞中發(fā)揮著促進腫瘤轉移作用最顯著和最重要的通路之一。
為了確認KRT18是否通過調控EMT信號通路的活化影響As PC-1和CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞轉移。我們通過Western blot檢測各組KRT18、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白及Snail的蛋白表達水平。由于在第一部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)c-Myc通路在高代謝亞型中明顯激活,而且c-Myc通路是在癌細胞中發(fā)揮著促癌作用最顯著和最重要的通路之一?？捎绊懠毎脑鲋?、細胞周期、凋亡等多種過程。
為了進一步確認KRT18是否通過調控c-Myc信號通路的活化影響As PC-1和CAPAN-2人胰腺癌貼壁細胞系細胞轉移。我們通過Western blot檢測各組KRT18和c-Myc的蛋白表達水平。最后,為了進一步確定KRT18促進胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和轉移是否通過c-Myc通路介導。首先過表達KRT18,然后檢測c-Myc通路是否激活以及增殖、遷移、侵襲的表型是否被促進,最后通過c-Myc通路抑制劑檢查這些被促進的過程是否得到有效回復。通過這樣的rescue回復實驗,檢驗c-Myc通路是否可以介導KRT18的功能。為了進一步明確其在胰腺癌細胞中的作用,我們通過構建10只裸鼠胰腺癌移植瘤動物模型,在體內探究KRT18對胰腺癌腫瘤的生長作用。Western blot實驗和IHC實驗檢測不同模型分組組織中KRT18的表達量。
參考文獻
[1] Decreased miR-940 expression can predict a negative prognosis in early-stage nonsmoking female lung adenocarcinoma..Ma Qianli;Zhang Jin;Huang Jingjing;Wang Xiaowei;Xiao Fei;Xing Huajie;Wang Ye;Guo Yongqing;Shi Bin;Song Zhiyi;Liu Deruo;Si Chaozeng;Horinouchi Hidehito;Liang Chaoyang.Translational lung cancer research,2021
[2]Total Keratin-18(M65)as a Potential,Early,Non-Invasive Biomarker of Hepatocyte Injury in Alcohol Intoxicated Adolescents—A Preliminary Study.Zdanowicz Katarzyna;Olanski Witold;KowalczukKryston Monika;BobrusChociej Anna;Werpachowska Irena;Lebensztejn Dariusz Marek.Biomolecules,2021
[3]Diagnostic and prognostic impact of cytokeratin 18 expression in human tumors:a tissue microarray study on 11,952 tumors..Menz Anne;Weitbrecht Timo;Gorbokon Natalia;Büscheck Franziska;Luebke Andreas M;Kluth Martina;HubeMagg Claudia;Hinsch Andrea;H?flmayer Doris;Weidemann S?ren;Fraune Christoph;M?ller Katharina;Bernreuther Christian;Lebok Patrick;Clauditz Till;Sauter Guido;Uhlig Ria;Wilczak Waldemar;Steurer Stefan;Minner Sarah;Burandt Eike;Krech Rainer;Dum David;Krech Till;Marx Andreas;Simon Ronald.Molecular medicine(Cambridge,Mass.),2021
[4]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries.Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021
[5]高楊.KRT18增強c-Myc通路促進胰腺癌增殖、侵襲、轉移的分子機制研究[D].中國醫(yī)科大學,2023.