背景^[1-3]

人惡性黑色素瘤細(xì)胞是人惡性黑色素瘤細(xì)胞的一種。細(xì)胞源自人類(lèi)皮膚，屬于非整倍體腫瘤細(xì)胞系，通常用于研究黑色素瘤等人類(lèi)皮膚腫瘤。

人惡性黑色素瘤細(xì)胞

人惡性黑色素瘤細(xì)胞使用說(shuō)明：

1.人惡性黑色素瘤細(xì)胞株的復(fù)蘇

a.將凍存管在37℃水浴鍋中迅速完全融化(保持凍存管的蓋子在液面以上以防止污染)，并適當(dāng)輕輕搖晃促融，切勿vortex?？焖?、完全融化可以提高細(xì)胞的復(fù)蘇效果。

b.打開(kāi)凍存管前時(shí)用70%酒精擦拭細(xì)胞凍存管外壁，注意某些記號(hào)筆不耐酒精，小心標(biāo)注的記號(hào)被擦拭掉。

c.將完全融化的細(xì)胞直接離心，或者轉(zhuǎn)移至無(wú)菌1.5ml或其它合適無(wú)菌離心管中，500×g離心2-5min，吸除上清，注意不要吸走細(xì)胞沉淀，然后用新鮮完全培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)器皿，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

d.第二天視貼壁或生長(zhǎng)狀態(tài)，更換培養(yǎng)液。

2.人惡性黑色素瘤細(xì)胞的常規(guī)傳代流程

a.將細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS等放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

b.以10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿為例。吸出原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用2-5ml無(wú)菌PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次以去除殘留的血清(如果細(xì)胞貼壁較差，潤(rùn)洗時(shí)要輕柔以避免細(xì)胞飄起)，然后加1-2ml胰酶細(xì)胞消化液(含EDTA)室溫消化，注意消化時(shí)間，通常為1-5分鐘。如果細(xì)胞比較難消化，可以置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱一定時(shí)間以加速消化。注意：消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致傳代后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)不良的情況。

c.每30秒-1分鐘用顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，貼壁細(xì)胞明顯收縮、細(xì)胞間間隙變大、細(xì)胞趨于圓形但還未漂起，并用移液器吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液，再加入1-2ml新鮮完全培養(yǎng)液，適當(dāng)晃動(dòng)細(xì)胞皿以終止胰酶作用，用移液器輕輕吹打貼壁的細(xì)胞，獲取細(xì)胞懸液。吹打時(shí)需控制力度，避免產(chǎn)生大量氣泡，將細(xì)胞懸液分別接種到另外的2~5個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入新鮮培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況。

d.也可以在消化后，加3-5ml完全培養(yǎng)液終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液，盡量把細(xì)胞全部吹落、吹散，然后將全部細(xì)胞懸液500×g離心2-5min，離心后去上清，再用完全培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適量完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

e.注意培養(yǎng)液的酚紅顏色變化或根據(jù)細(xì)胞的換液要求定期換液，待細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)需要傳代或者凍存。如果沒(méi)有及時(shí)傳代導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)密，傳代后細(xì)胞容易出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)不良的情況。

應(yīng)用^[4-5]

人惡性黑色素瘤細(xì)胞可以用于β-catenin對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

惡性黑色素瘤是一種較常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于皮膚部，惡性程度高，平均生存期約30.3個(gè)月，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前，治療惡性黑色素瘤主要的手段有手術(shù)及抗腫瘤治療（化療、放療、生物治療），但其療效均較差。

利用含有β-catenin特異序列RNA干擾慢病毒沉默β-catenin蛋白的表達(dá)，以此阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觀察β-catenin沉默對(duì)惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響。

探討通過(guò)沉默Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin，觀察β-catenin對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的影響，從而為惡性黑色素瘤的治療提供依據(jù)。

方法：1.制作干擾慢病毒液：β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干擾慢病毒液)和β-catenin-negative-LV(空載體慢病毒液)。分別感染人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞，得到的穩(wěn)定感染細(xì)胞株分別標(biāo)記為A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法檢測(cè)感染后的A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平，并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。

2. MTT法分別檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞增殖能力，并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。

3. 采用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞平板克隆形成能力，并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。

4. 采用Transwell法檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞體外趨化侵襲、遷移能力，并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。

5. 流式細(xì)胞術(shù)亞G1峰法檢測(cè)A375-RNAi、A375-negative細(xì)胞的凋亡率，并以未感染的細(xì)胞作對(duì)照。

結(jié)果：1.Western Blot結(jié)果顯示：β-catenin在人惡性黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)，β-catenin在A375-RNAi細(xì)胞中的表達(dá)量下降，A375-RNAi細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)量較未感染的A375細(xì)胞下降約55.1%（P<0.05），證實(shí)β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默；A375-negative細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)量與A375細(xì)胞無(wú)明顯差異（P>0.05）。

2. MTT結(jié)果顯示：A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞相比增殖活性均降低(P＜0.05)；A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3. 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果：A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞平板克隆形成能力相比均減低(P＜0.05)；A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞平板克隆形成能力無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

4. Transwell結(jié)果顯示：A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞侵襲、遷移能力相比均顯著下降(P＜0.05)，A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

5. 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：A375-RNAi細(xì)胞與A375-negative細(xì)胞、A375細(xì)胞相比凋亡率明顯增高(P＜0.05)；A375-negative細(xì)胞較A375細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異性(P＞0.05)。

結(jié)論：1.慢病毒載體介導(dǎo)siRNA能有效沉默人惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)。

2.下調(diào)β-catenin表達(dá)能使人黑色素細(xì)胞瘤A375細(xì)胞增殖變緩，細(xì)胞克隆形成能力減弱，細(xì)胞侵襲、遷移能力下降，細(xì)胞凋亡率增加。β-catenin有望成為治療人惡性黑色素瘤有效靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Cancer statistics,2014.Rebecca Siegel;;Jiemin Ma;;Zhaohui Zou;;Ahmedin Jemal.CA A Cancer Journal for Clinicians,2014

[2]Altered expression of Krüppel-like factor 4 andβ-catenin in human gastriccancer.N.Zhang;;J.Zhang;;Z.W.Wang;;L.Zha;;Z.Huang.Oncology Letters,2012

[3]A Re-evaluation of the“Oncogenic”Nature of Wnt/β-catenin Signaling in Melanoma and Other Cancers.Olivia M.Lucero;;David W.Dawson;;Randall T.Moon;;Andy J.Chien.Current Oncology Reports,2010

[4]Defining the Conditions for the Generation of Melanocytes from Human Embryonic Stem Cells.DongFang;KimLeishear;Thiennga K.Nguyen;RenaFinko;KunCai;MizuhoFukunaga;LingLi;Patricia A.Brafford;Angela N.Kulp;XiaoweiXu;Keiran S.M.Smalley;MeenhardHerlyn.STEM CELLS,2009

[5]楊躍.β-catenin對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響[D].南昌大學(xué),2015.