背景[1-3]
HEK293人胚腎細(xì)胞系也被稱為人胚胎腎細(xì)胞293（Human Embryonic Kidney 293），它是一種永生化細(xì)胞系，衍生自人胚胎腎臟。這些細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高，易于培養(yǎng)等特點。HEK293細(xì)胞系是由荷蘭生物學(xué)家Alex van der Eb在1973年從人類腎臟細(xì)胞中首次分離出來的。這些細(xì)胞是在女性胎兒的組織培養(yǎng)物中生長的。后來，Van der Eb實驗室的博士后研究員Frank Graham對這些細(xì)胞進(jìn)行了剪切的人類腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)染，使其能夠非常有效地產(chǎn)生大量重組蛋白。因此，該細(xì)胞系被命名為HEK293，以紀(jì)念這次實驗是Frank Graham的第293次實驗。
HEK293人胚腎細(xì)胞系
HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
HEK293人胚腎細(xì)胞系可以用于氧化應(yīng)激在氫醌致人胚腎細(xì)胞HEK293 DNA損傷中的作用
氫醌(1,4-dihydroxybenzene,HQ)是一種重要的工業(yè)化學(xué)品,可作為攝影工業(yè)的顯影劑,橡膠工業(yè)的抗氧化劑,食品的抗氧化劑生產(chǎn)中間體,并作為聚合乙烯和丙烯酸為單體抑制劑。日常生活中通過某些藥物、化妝品也可長時間接觸。HQ是苯的代謝物,在苯毒性效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。HQ主要在肝內(nèi)代謝,經(jīng)尿排出而解毒；部分富集于骨髓組織,進(jìn)一步代謝生成對苯醌和對苯半醌。人群流行病調(diào)查及實驗動物研究均發(fā)現(xiàn)長期接觸HQ可對肝、腎、骨髓造血造成損傷。1999年,國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)就將HQ歸為第三類致癌物,即現(xiàn)有證據(jù)尚不能就其對人類致癌性進(jìn)行分類。體外實驗表明,HQ可引起染色體突變。
研究選用HEK293細(xì)胞作為試驗系統(tǒng),探討HQ的DNA損傷作用及可能機制,旨在為評估HQ對人類健康的危害提供有價值的實驗室依據(jù)。
方法：試驗系統(tǒng)為HEK293人胚腎細(xì)胞系。通過改良的單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗檢測細(xì)胞DNA損傷情況。通過羅丹明123(Rh123)和吖啶橙(AO)分別測定細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位和溶酶體膜穩(wěn)定性；通過2’,7’—二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和苯二醛(OPT)分別測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及還原型谷胱甘肽(GSH)水平。用免疫組化方法測定8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。為探討其可能的氧化性機制,采用DL—甲硫氨酸磺酰亞胺(BSO)和抗氧化物質(zhì)羥基酪醇(HT)干預(yù)法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位對HQ所致DNA損傷效應(yīng)的影響。
結(jié)果：HQ(3.125,6.25,12.5μM)作用于細(xì)胞后,DNA的遷移距離明顯增加,且呈劑量依賴關(guān)系；作用于HEK293細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性的破壞和線粒體膜電位的下降,也可使細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平的明顯增加及GSH的耗竭；明顯增加HEK293人胚腎細(xì)胞系內(nèi)8-OHdG水平。HT能夠拮抗HQ引起的DNA鏈斷裂的形成；BSO能夠加劇HQ引起的DNA鏈斷裂的損傷。
結(jié)論：HQ可致HEK293人胚腎細(xì)胞系DNA損傷,其作用機制可能是通過線粒體膜電位的下降,溶酶體膜破壞,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增高及GSH的耗竭,進(jìn)而導(dǎo)致氧化性DNA損傷。
參考文獻(xiàn)
[1]Induction of micronuclei in V79 cells by the anabolic doping steroids tetrahydrogestrinone and trenbolone.Susanne B.Dorn;;Hermann M.Bolt;;Mario Thevis;;Patrick Diel;;Gisela H.Degen.Archives of Toxicology,2008
[2]DNA protecting and genotoxic effects of olive oil related components in cells exposed to hydrogen peroxide.Lambros Nousis;;Paschalis-Thomas Doulias;;Nektarios Aligiannis;;Dimitrios Bazios;;Apostolos Agalias;;Dimitrios Galaris;;Sofia Mitakou.Free Radical Research,2005
[3]The Aging Myocardium:Roles of Mitochondrial Damage and Lysosomal Degradation.Alexei Terman;;Ulf T.Brunk.Heart,Lung and Circulation,2005
[4]Cadmium chloride-induced DNA and lysosomal damage in a hepatoma cell line.George Fotakis;;Eduardo Cemeli;;Diana Anderson;;John A.Timbrell.Toxicology in Vitro,2005
[5]施琳琳.氧化應(yīng)激在氫醌致人胚腎細(xì)胞HEK293 DNA損傷中的作用[D].大連醫(yī)科大學(xué),2010.