背景[1-3]
FRHK-4恒河猴胚腎細胞系是一種常用的細胞系，源自300克重恒河猴正常雌性胚胎的腎組織。這種細胞系是上皮細胞樣的連續(xù)細胞株，已經(jīng)被數(shù)家實驗室用作甲型肝炎研究。
FRHK-4恒河猴胚腎細胞系具有上皮細胞的特性，生長特征是貼壁生長。其倍增時間大約為每周2至3次，可以在含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該細胞系已通過支原體檢測，是連續(xù)細胞系，適合于一般上皮細胞的培養(yǎng)。
在培養(yǎng)過程中，應(yīng)將FRHK-4恒河猴胚腎細胞系放在含有95%空氣和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，溫度維持在37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
FRHK-4恒河猴胚腎細胞系
FRHK-4恒河猴胚腎細胞系培養(yǎng)步驟：
1）復(fù)蘇FRHK-4恒河猴胚腎細胞系細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）FRHK-4恒河猴胚腎細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1、對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）FRHK-4恒河猴胚腎細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
應(yīng)用[4-5]
FRHK-4恒河猴胚腎細胞系可以用于豬輪狀病毒實時定量熒光PCR檢測方法的建立
豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus,PRV)屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬,它作為腹瀉的主要病原在世界范圍內(nèi)廣泛流行,是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一。該病幼畜最為易感,1～4周齡仔豬發(fā)病率超過80%,死亡率7～20%,且癥狀嚴重,主要表現(xiàn)為嚴重腹瀉,部分病例因嚴重脫水、酸堿平衡失調(diào)、繼發(fā)感染而死亡。鑒于其危害嚴重且沒有有效治療手段,所以對于輪狀病毒的提前診斷預(yù)防尤其重要。在輪狀病毒的檢測技術(shù)中,實時熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,real time FQ-PCR)大多都以SYBR GreenⅠ染料提供熒光信號,能夠有效解決常規(guī)PCR的污染問題,特異性更強,自動化程度更高,可滿足對多種樣本檢測的需要,已經(jīng)得到廣泛的認可。
實驗先從甘肅某豬場發(fā)生腹瀉的豬群中采集糞便樣品,用FRHK-4恒河猴胚腎細胞系培養(yǎng),并擴增了PRV,再根據(jù)Genebank上已提交的多株豬輪狀病毒VP6基因編碼序列,利用primers premier 5.0軟件設(shè)計引物。對采集的樣品進行處理及病毒RNA抽提,以O(shè)ligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄的引物,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進而以設(shè)計的一對引物及合適的條件進行PCR擴增,目的是建立一種快速、準確、特異的PRV real time FQ-PCR檢測方法。
本實驗對FRHK-4恒河猴胚腎細胞系細胞、病毒做了擴增培養(yǎng),成功提取出病毒RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,擴增出長1100bp左右的基因片段,初步建立了熒光定量檢測方法,根據(jù)最后得到熒光定量PCR圖,看出陰性樣品與空白對照的熒光曲線均為直線,而陽性樣品熒光曲線則有很明顯的上升,且曲線上升高低與模板濃度呈正比,且可初見“S”型曲線。本次試驗為今后進行PRV分子流行病學(xué)研究、分子診斷試劑的開發(fā)以及基因工程疫苗的研制提供了一些理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
參考文獻
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[3]Simultaneous detection and identification of hepatitis A virus and rotavirus by multiplex nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)and microtiter plate hybridization system..Journal of Virological Methods,2002
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[5]宋昌軍.豬輪狀病毒實時定量熒光PCR檢測方法的建立[D].西北民族大學(xué),2010.