背景[1-3]
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞是一種原代細胞，來源于腦組織，通常用于科研實驗。這種細胞具有特定的生理功能，如合成和分泌神經(jīng)遞質(zhì)等。
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞是一種神經(jīng)元，位于下丘腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中。它們與其他神經(jīng)元一起構(gòu)成了下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，該軸對身體的應(yīng)激反應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)起著重要作用。
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞通常具有長而細的軸突，這些軸突延伸到垂體前葉并釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)。CRH刺激垂體前葉分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，進而刺激腎上腺皮質(zhì)分泌皮質(zhì)醇等激素。這些激素可以調(diào)節(jié)身體的應(yīng)激反應(yīng)、免疫系統(tǒng)和代謝功能。
除了HPA軸外，大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞還與其他神經(jīng)元相互作用，參與調(diào)節(jié)食欲、性行為、體溫和睡眠等生理過程。例如，它們可以與下丘腦內(nèi)的食欲調(diào)節(jié)中樞相互作用，控制食欲和能量代謝；也可以與下丘腦內(nèi)的性行為中樞相互作用，調(diào)節(jié)性行為和生殖功能。
在科研實驗中，大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞常被用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的基本生理過程，如神經(jīng)信號的傳遞、神經(jīng)細胞的電活動等。此外，這種細胞也常被用于藥物篩選和毒性測試等領(lǐng)域。
在培養(yǎng)大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞時，需要提供適宜的培養(yǎng)條件，如適宜的溫度、濕度和營養(yǎng)物質(zhì)等。同時，還需要注意細胞的生長狀態(tài)和物種來源等信息，以確保細胞的健康和穩(wěn)定性。
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞可以用于調(diào)更湯調(diào)控ASK1/MKK7/JNK信號通路改善下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡的作用機制研究
基于前期研究發(fā)現(xiàn)“調(diào)更湯”能夠改善下丘腦氧化損傷、延緩下丘腦神經(jīng)組織衰老的結(jié)果,本實驗通過動物實驗及細胞實驗研究“調(diào)更湯”改善大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡發(fā)揮中樞神經(jīng)保護作用,及其調(diào)控ASK1/MKK7/JNK信號通路發(fā)揮抗凋亡作用的分子機制,闡釋“調(diào)更湯”治療絕經(jīng)綜合征的可能機理,為推廣“調(diào)更湯”的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
方法：動物實驗:120只SPF級4月齡雌性SD大鼠,分為假手術(shù)組(Sham)、去勢手術(shù)組(OVX)、戊酸雌二醇組(OVX+Ev)、調(diào)更湯低劑量組(OVX+TG 9.69g)、調(diào)更湯中劑量組(OVX+TG 19.37g)及調(diào)更湯高劑量組(OVX+TG 38.74g)六個組。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,一組行假手術(shù),另外五組切除雙側(cè)卵巢。造模成功后,Sham組及OVX組給予生理鹽水灌胃,OVX+Ev組給予戊酸雌二醇(0.12 mg/kg)灌胃,調(diào)更湯低、中、高劑量組分別給予三種不同劑量的中藥調(diào)更湯灌胃。治療4周后,運用Nissl染色法觀察大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞病理形態(tài)學(xué)改變;運用透射電子顯微鏡觀察下丘腦神經(jīng)細胞的超微結(jié)構(gòu)改變;運用TUNEL染色法檢測下丘腦神經(jīng)細胞凋亡率;運用q RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測Bcl-2家族基因及蛋白變化情況;運用Western blot技術(shù)檢測ASK1/MKK7/JNK通路相關(guān)蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表達。
細胞實驗:將大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞傳代2-3代。
取處于生長對數(shù)期的大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞隨機2萬細胞每孔鋪板96孔板,CCK-8法篩選調(diào)更湯干預(yù)GT1-7細胞的濃度;取處于生長對數(shù)期的GT1-7細胞隨機分為對照組(Con),模型組(TBTC),17β-E2組(17β-E2),調(diào)更湯低劑量組(TG 31.25μg/m L),調(diào)更湯中劑量組(TG 62.5μg/m L)及調(diào)更湯高劑量組(TG 125μg/m L)。CCK8法檢測TBTC作用于GT1-7細胞活力實驗;光鏡下觀察細胞形態(tài);Hoechst33258染色法觀察凋亡細胞核形態(tài);Annexin V-FITC/PI雙染色流式技術(shù)檢測GT1-7細胞凋亡水平;TMT磷酸化修飾定量蛋白組學(xué)經(jīng)生信分析相關(guān)通路及差異蛋白;應(yīng)用q RT-PCR技術(shù)、Western blot技術(shù)檢測Bcl-2、Bax基因及蛋白變化情況;運用Western blot技術(shù)檢測ASK1/MKK7/JNK通路相關(guān)的蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表達。
參考文獻
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