背景^[1-3]

HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）指的是人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞在視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)中扮演著重要的角色，負(fù)責(zé)維持視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。

在醫(yī)學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）通常被用于研究視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。例如，糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病都可能與HRCEC的功能異常有關(guān)。通過培養(yǎng)和研究HRCEC，科學(xué)家們可以更好地了解這些疾病的發(fā)展過程，并尋找有效的治療方法。

此外，HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）也被用于藥物篩選和細(xì)胞治療等研究中。例如，科學(xué)家們可以利用HRCEC來測試新藥物對(duì)視網(wǎng)膜疾病的療效，或者將HRCEC用于細(xì)胞移植治療，以修復(fù)受損的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。

HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）

HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）可以用于阿魏酸鈉對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用以及VEGF表達(dá)的影響

研究不同濃度的阿魏酸鈉(sodium ferulate, SF)對(duì)體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells, HRCEC)的增殖以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達(dá)的影響。從而為糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诘念A(yù)防及治療提供新的研究思路以及理論依據(jù)。

方法：眼科手術(shù)所提取的HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測FⅧr-Ag鑒定培養(yǎng)的HRCEC。取第3～4代生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)置分組為空白對(duì)照組、低糖對(duì)照組、高糖對(duì)照組、高糖+不同濃度阿魏酸(1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L)組,用噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測48h后不同質(zhì)量濃度的阿魏酸鈉對(duì)體外高糖環(huán)境下HRCEC增殖作用，通過免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況。

結(jié)果1、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測體外原代培養(yǎng)的HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞），Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體染色，呈陽性染色；

2、MTT比色法結(jié)果顯示：用1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L的阿魏酸鈉作用于原代培養(yǎng)的高糖環(huán)境下HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）48h，細(xì)胞增殖抑制率分別為46.97%、61.55%、76.91%、83.47%。在相同的時(shí)間作用條件下，一定質(zhì)量濃度范圍的阿魏酸鈉對(duì)高糖環(huán)境下HRCEC的增殖具有抑制作用（P <0.05），隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率反而逐漸下降，抑制率逐漸提高。低糖對(duì)照組與高糖對(duì)照組相比較結(jié)果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.068>0.05）。

3、免疫化學(xué)法檢測顯示：低糖對(duì)照組、高糖對(duì)照組與不同濃度的阿魏酸鈉（1mg/L，2mg/L，4mg/L）作用于HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）48h后化學(xué)背景灰度值與陽性灰度值之差分別為28.27±1.62，93.67±0.81，72.67±2.89，53.73±1.70，30.93±3.72。通過48h后加藥組和高糖對(duì)照組相比，VEGF表達(dá)明顯下降，差異性明顯，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，具有質(zhì)量濃度依賴性。與低糖對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組VEGF的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

結(jié)論 1、阿魏酸鈉對(duì)體外環(huán)高糖境下培養(yǎng)的HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）的增殖具有抑制作用，且呈質(zhì)量濃度依賴性，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2、阿魏酸鈉可以下調(diào)HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的VEGF的表達(dá)，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性； 3、阿魏酸鈉抑制視網(wǎng)膜新生血管可能是通過下調(diào)HRCEC（人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）中VEGF表達(dá)。

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