背景^[1-3]

TOP10感受態(tài)細(xì)胞是一種經(jīng)過(guò)特殊處理的細(xì)胞，具有高效轉(zhuǎn)化外源DNA的能力。這種細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和遺傳工程領(lǐng)域，用于轉(zhuǎn)化和表達(dá)外源基因。

TOP10感受態(tài)細(xì)胞的主要特點(diǎn)包括高轉(zhuǎn)化效率、穩(wěn)定性好以及基因突變少。這使得它成為處理難以轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒的理想選擇。相比其他常見(jiàn)的感受態(tài)細(xì)胞，如DH5α，TOP10在某些方面可能具有優(yōu)勢(shì)。

制備TOP10感受態(tài)細(xì)胞的過(guò)程通常涉及使用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)。這通常包括處理細(xì)胞以提高其通透性，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。

在使用TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA。然后，通過(guò)一系列的溫度變化和處理步驟，如冰浴、熱激和復(fù)蘇培養(yǎng)，促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。

TOP10感受態(tài)細(xì)胞

TOP10感受態(tài)細(xì)胞是一種高效、穩(wěn)定的工具，用于在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)研究。然而，具體的應(yīng)用和效果可能因?qū)嶒?yàn)條件和目的的不同而有所差異。因此，在使用TOP10感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，建議參考相關(guān)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和文獻(xiàn)，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

制備和使用TOP10感受態(tài)細(xì)胞的操作步驟主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

制備TOP10感受態(tài)細(xì)胞：

1.取適量TOP10菌液，接種至含適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中，并在適宜的溫度和搖床速度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，進(jìn)行洗滌和離心，以去除培養(yǎng)基和其他雜質(zhì)。

3.使用特定的化學(xué)試劑（如氯化鈣）處理細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞易于接受外源DNA。

4.將制備好的感受態(tài)細(xì)胞保存在適當(dāng)?shù)臈l件下，以備后續(xù)使用。

5.取適量制備好的TOP10感受態(tài)細(xì)胞，加入需轉(zhuǎn)化的外源DNA（如質(zhì)粒）。

6.在冰上靜置一段時(shí)間，使DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。

7.進(jìn)行熱激處理，一般是在42℃水浴中短暫加熱，以促使DNA進(jìn)入細(xì)胞。

8.熱激后立即將細(xì)胞置于冰上冷卻，并加入營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。

9.將復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌液涂布于含有適當(dāng)抗生素的固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)。

10.觀察培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況，挑選出可能含有轉(zhuǎn)化DNA的菌落。

11.對(duì)挑選出的菌落進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，如PCR擴(kuò)增、測(cè)序等，以確認(rèn)是否成功轉(zhuǎn)化了所需的外源DNA。

應(yīng)用^[4-5]

TOP10感受態(tài)細(xì)胞可以用于表達(dá)H9N2禽流感病毒HA2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建與免疫效果研究

將H9N2 AIV的主要保護(hù)性抗原HA2分別導(dǎo)入乳酸菌組成型表達(dá)系統(tǒng)和誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了兩株表達(dá)H9N2 AIV HA2蛋白的重組乳酸菌,旨在開(kāi)發(fā)能夠防控H9N2 AIV的新型制劑。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.表達(dá)H9N2 AIV HA2蛋白重組乳酸桿菌和重組乳酸乳球菌的構(gòu)建:對(duì)H9N2 AIV流行毒株提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為c DNA,擴(kuò)增HA2全基因,連接至p MD18-T質(zhì)粒,熱激轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建出克隆質(zhì)粒p MD18-T-HA2。選擇NcoⅠ和HindⅢ雙酶切p32-p SIP409質(zhì)粒,將線性化載體p32-p SIP409和基因片段HA2通過(guò)同源重組酶連接,熱激轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化入植物乳桿菌NC8感受態(tài)細(xì)胞,利用紅霉素抗性篩選陽(yáng)性菌株。提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證,含正確重組質(zhì)粒的菌株命名為p32-p SIP409-HA2/NC8。重組菌株30℃靜置過(guò)夜自發(fā)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)目的蛋白特異性,結(jié)果顯示重組植物乳桿菌p32-p SIP409-HA2/NC8成功表達(dá)27 k Da HA2蛋白。選擇NcoⅠ和KpnΙ同時(shí)雙酶切HA2基因片段和p NZ8149質(zhì)粒,通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞,利用Elliker培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌株。提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證,含正確重組質(zhì)粒的菌株命名為p NZ8149-HA2/NZ3900。通過(guò)Nisin對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)目的蛋白特異性,結(jié)果顯示重組乳酸乳球菌p NZ3900-HA2/NZ3900成功表達(dá)27k Da HA2蛋白。

參考文獻(xiàn)

[1]Infectious Bronchitis Virus Infection Increases Pathogenicity of H9N2 Avian Influenza Virus by Inducing Severe Inflammatory Response[J].Kong Lingchen;You Renrong;Zhang Dianchen;Yuan Qingli;Xiang Bin;Liang Jianpeng;Lin Qiuyan;Ding Chan;Liao Ming;Chen Libin;Ren Tao.Frontiers in Veterinary Science,2022

[2]Generation and evaluation of a recombinant goose origin Newcastle disease virus expressing Cap protein of goose origin avastrovirus as a bivalent vaccine in goslings[J].Xu;;Li;;Liu;;Chen;;Jia.Poultry Science,2019

[3]Avian Influenza A Virus Infection among Workers at Live Poultry Markets,China,2013-2016.[J].Ma Mai-Juan;;Zhao Teng;;Chen Shan-Hui;;Xia Xian;;Yang Xiao-Xian;;Wang Guo-Lin;;Fang Li-Qun;;Ma Guan-Yuan;;Wu Meng-Na;;Qian Yan-Hua;;Dean Natalie E;;Yang Yang;;Lu Bing;;Cao Wu-Chun.Emerging infectious diseases,2018

[4]Influenza.[J].Krammer Florian;;Smith Gavin J D;;Fouchier Ron A M;;Peiris Malik;;Kedzierska Katherine;;Doherty Peter C;;Palese Peter;;Shaw Megan L;;Treanor John;;Webster Robert G;;García-Sastre Adolfo.Nature reviews.Disease primers,2018

[5]李雨欣.表達(dá)H9N2禽流感病毒HA2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建與免疫效果研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2024.