背景^[1-3]

WISH人羊膜細(xì)胞指的是從人羊膜組織中提取和培養(yǎng)的細(xì)胞。羊膜是胎盤(pán)的最內(nèi)層組織，位于胎兒絨毛膜的表面，與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密，同時(shí)也是母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜細(xì)胞，特別是羊膜上皮細(xì)胞，具有多種獨(dú)特的生物學(xué)特性，如多能干性、無(wú)限增殖性、抗炎特性，且沒(méi)有致瘤性和免疫原性。

WISH人羊膜細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。例如，它們可以用于修復(fù)受損的組織或器官，或者在疾病治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于人羊膜細(xì)胞具有無(wú)免疫排斥反應(yīng)的特性，治療時(shí)無(wú)需配型，這使得它們成為一種理想的種子細(xì)胞。

然而，WISH人羊膜細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)。例如，在實(shí)驗(yàn)室中，懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染（包括人羊膜細(xì)胞）通常比貼壁細(xì)胞更為困難，因?yàn)閼腋〖?xì)胞不易培養(yǎng)且易死亡。為了提高轉(zhuǎn)染效率，研究人員可能會(huì)嘗試使用非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑或電轉(zhuǎn)染方法。

此外，為了充分發(fā)揮人羊膜細(xì)胞的治療潛力，還需要深入研究其生物學(xué)特性、分化能力以及與宿主組織的相互作用?？偟膩?lái)說(shuō)，WISH人羊膜細(xì)胞是一個(gè)充滿潛力的研究領(lǐng)域，有望在未來(lái)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。

WISH人羊膜細(xì)胞

WISH人羊膜細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇WISH人羊膜細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)WISH人羊膜細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)WISH人羊膜細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

WISH人羊膜細(xì)胞可以用于苯丙氨酸衍生物對(duì)7種細(xì)胞系的生物學(xué)作用研究

L-4-氟苯丙氨酸（Fp）是人體中一些羥化酶的抑制劑，具有抗腫瘤作用。L-4-氯苯丙氨酸（Clp）是促黃體激素釋放激素的拮抗物。L-4-磷酸基-苯丙氨酸（Pp）是許多酪氨酸磷酸酶的底物，能使癌細(xì)胞生長(zhǎng)停止在細(xì)胞周期的S期。然而，苯丙氨酸還有許多其他衍生物，如L-4-溴（Bp）、碘（Ip）、氨基（Ap）、硝基（Np）、磺酸基（Sp）、甲氧基（Mp）、氰基（Cp）-苯丙氨酸等，它們的生物學(xué)作用如何，值得深入研究。為此，我們用MTT方法檢測(cè)了上述10種苯丙氨酸衍生物對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16、人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO、人宮頸癌細(xì)胞系Hela、WISH人羊膜細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29的細(xì)胞活性影響。此外，用Hoechst染色方法檢測(cè)這10種苯丙氨酸衍生物對(duì)上述7種細(xì)胞系凋亡的誘導(dǎo)作用，以及用甲基纖維素集落形成的方法檢測(cè)10種苯丙氨酸衍生物對(duì)上述7種細(xì)胞集落形成的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10種苯丙氨酸衍生物對(duì)7種細(xì)胞（對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16、人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO、人宮頸癌細(xì)胞系Hela、WISH人羊膜細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29）的活性影響、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞成集落三方面有差異。Fp、Ip、Mp這三種衍生物對(duì)上述7種細(xì)胞系活性有影響，并且Hoechst染色結(jié)果表明它們能夠誘導(dǎo)上述7種細(xì)胞系（對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16、人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO、人宮頸癌細(xì)胞系Hela、WISH人羊膜細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29）凋亡，因此說(shuō)明Fp、Mp、Ip通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞活性。Bp、Sp、Pp有抑制上述7種細(xì)胞系集落形成的作用，說(shuō)明它們通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)影響細(xì)胞的活性。Ap、Np對(duì)細(xì)胞的毒性較弱，細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，它們有抑制細(xì)胞集落形成的作用，因此它是通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)影響細(xì)胞活性。它們對(duì)7種細(xì)胞的活性大小有差異，Ap對(duì)CHO細(xì)胞系的活性沒(méi)有影響，Np對(duì)HT-29、WISH人羊膜細(xì)胞、A549這三種細(xì)胞系的活性有影響。Hoechst染色結(jié)果表明它們沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Clp除了對(duì)MCF-7和HT-29兩種細(xì)胞系的活性有影響外，對(duì)其它細(xì)胞沒(méi)有影響。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)這兩種細(xì)胞集落形成的抑制作用大于對(duì)其它細(xì)胞，因此，它通過(guò)抑制MCF-7和HT-29兩種細(xì)胞系的生長(zhǎng)從而影響細(xì)胞活性。Cp對(duì)7種細(xì)胞系活性沒(méi)有影響，并且Hoechst染色和細(xì)胞成集落實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)7種細(xì)胞沒(méi)有明顯作用。

參考文獻(xiàn)

[1]“Where,O Death,Is Thy Sting?”A Brief Review of Apoptosis Biology[J].Andrew H.Wyllie.Molecular Neurobiology,2010(1)

[2]The PTEN-AKT3 signaling cascade as a therapeutic target in melanoma.[J].Madhunapantula Subbarao V;;Robertson Gavin P.Pigment cell&melanoma research,2009

[3]Members of the EGF receptor family in normal and pathological epidermis.[J].Poumay Yves;;Mitev Vanio.Folia medica,2009

[4]Aquaporins and cell migration.[J].Papadopoulos M C;;Saadoun S;;Verkman A S.Pflugers Archiv:European journal of physiology,2008

[5]陳冉.苯丙氨酸衍生物對(duì)7種細(xì)胞系的生物學(xué)作用研究[D].河南師范大學(xué),2012.