背景及概述[1]
大腸桿菌經(jīng)Ca離子處理后可攝取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱作感受態(tài)細(xì)胞(Competent Cells)。DH10Bac感受態(tài)主要用于生產(chǎn)重組桿狀病毒分子（Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）。DH10Bac菌株中含有父本桿粒 bMON14272 、輔助質(zhì)粒 pMON7124 ：父本桿粒 bMON14272包含 mini-F復(fù)制子, 卡那抗性基因, attTn7 位點(diǎn)和 lacZα互補(bǔ)因子；輔助質(zhì)粒 pMON7124 含有 tnsABCD區(qū)（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四環(huán)素抗性，在細(xì)胞擴(kuò)增過程中丟失，但可提高供體質(zhì)粒pFastBac轉(zhuǎn)化后的基因轉(zhuǎn)座效率。
mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15 的存在使DH10Bac可用于藍(lán)白斑篩選。
操作方法[1]
1.DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻，待菌體處于冰水混合狀態(tài)時(shí)迅速插入冰中），加入目 的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。
2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3. 向離心管中加入700ul不含抗生素的無菌培養(yǎng)液（2YT或LB），混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。
4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100ul左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少13h。
注意事項(xiàng)[1]
1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。
2. 混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
應(yīng)用[2-3]
CN201410315228.X公開一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單位疫苗，該蛋白系將含有KDEL3基因序列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素A基因序列和S1(m)基因序列的融合基因片段PE(△III)-S1(m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉(zhuǎn)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，將該重組桿狀質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組Sf9細(xì)胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得。本發(fā)明在對(duì)S1基因哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性優(yōu)化的基礎(chǔ)上，首次利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PE(△III)-S1(m)-KDEL3融合蛋白，以期獲得正確并高效表達(dá)融合蛋白的重組桿狀病毒。經(jīng)IFA和Western blot驗(yàn)證重組桿狀病毒可正確表達(dá)融合蛋白且融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
CN201310701927.3公開了一種對(duì)氧磷酶1基因的表達(dá)純化方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法是首先擴(kuò)增對(duì)氧磷酶1基因，連接到轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMⅠ上構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有對(duì)氧磷酶1基因的重組桿狀病毒DNA，將其轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，復(fù)制裝配成含對(duì)氧磷酶1基因的重組病毒后，接種家蠶五齡幼蟲，發(fā)病后取蠶血，經(jīng)離心過濾除雜并經(jīng)濃縮后用汽巴藍(lán)親和層析以及抗體親和層析純化蠶血，獲得對(duì)氧磷酶1蛋白。該方法實(shí)現(xiàn)了蛋白的高效表達(dá)且結(jié)構(gòu)接近天然蛋白，解決了天然PON1含量低、難純化的問題。
主要參考資料
[1] DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明
[2] CN201410315228.X一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單位疫苗
[3] CN201310701927.3對(duì)氧磷酶1基因的表達(dá)純化方法